穿山龍對支氣管哮喘大鼠CysLTs炎癥通路的影響研究

李保君，王 園，張亞軍

(內蒙古醫科大學 中醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

支氣管哮喘是一種慢性呼吸道非傳染性疾病，在各個年齡段的人群中多發，嚴重影響生活質量，給社會帶來經濟負擔，探索哮喘的預防方法并及時控制或緩解哮喘病情是當務之急。眾所周知，哮喘是由多種炎癥性細胞、炎癥性介質和炎癥性細胞因子互相協同作用的結果，氣道炎癥是哮喘最基本的發病特征之一[1-2]。目前治療支氣管哮喘的方法很多，一般采用抑制半胱氨酰白三烯(CysLTs)受體來阻斷CysLTs的炎癥通路，治療效果較好[3]。

1 哮喘中醫發病機制

中醫認為“久病必瘀血”，哮喘的發病機制是由于哮喘的反復發作，引起肺氣虛，造成氣虛無力推血，最后形成氣虛血瘀，故哮喘的防治要痰瘀同治，活血化瘀藥物是不二之選。其中，穿山龍具有抗炎、調節免疫、鎮咳祛痰等作用，臨床上常用來治療哮喘。穿山龍是薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，主要含有薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、25-△-螺旋甾-3，5-二烯、纖細薯蕷皂苷、穗菝葜甾苷、25-D-螺甾-3，5-二烯及對羥基芐基酒石酸等有效物質[4]。一般認為，穿山龍可通過降低炎癥通路上的主要炎癥因子從而發揮治療哮喘的作用，不過這種作用目前仍缺少客觀的實驗依據，本研究將通過大鼠實驗探討穿山龍治療哮喘的作用機制。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

健康SD雌性大鼠50只，體質量(200±20)g，生產批號：SAXK(蒙)2019-0015，購于內蒙古醫科大學動物實驗中心。按標準飼養條件飼養：給予標準實驗小鼠飼料，每天保證光照時間達12 h，關燈時間12 h，室溫一般控制在25 ℃ 左右，室內相對濕度一般控制在50%～70%。確保所有大鼠能自行進食、飲水，在標準飼養環境中喂養1周后開始造模[5]。

2.2 實驗用藥品

穿山龍制劑：飲片煎煮、濃縮、凍干制成穿山龍凍干粉。孟魯司特鈉片由杭州默沙東制藥有限公司提供。

2.3 主要試劑及儀器

主要試劑：氫氧化鋁，卵蛋白，戊巴比妥鈉，多聚甲醛溶液，蘇木素-伊紅(HE)染液，PBS磷酸鹽緩沖液，三氯甲烷，引物等。主要儀器：勻漿儀，熒光定量PCR儀，自動組織脫水機，光學顯微鏡等。

2.4 實驗方法

2.4.1 分組方法 經適應性喂養后，隨機把大鼠分成5組，每組10只，分別是正常組、哮喘哮喘模型組、孟魯司特鈉組、穿山龍組、穿山龍合孟魯司特鈉組，進行分籠喂養。

2.4.2 哮喘模型制作 根據PALMANS[6]所用方法復制哮喘模型，該方法分為兩個階段：第一階段是基礎致敏，采用腹腔注射卵清蛋白；第二階段是激發致敏，采用霧化吸入。除正常組，其余4組都進行以下操作：實驗第1天，取配置好的卵蛋白氫氧化鋁溶液1 mL腹腔注射(10 mg的卵蛋白與200 mg的氫氧化鋁混合)，進行基礎致敏；實驗第8天，重復第一天的操作以加強致敏；實驗第15天開始，進行激發致敏，采用2%卵蛋白生理鹽水溶液進行每日一次的霧化，每次霧化30 min，連續進行20 d。正常組在實驗第1天、第8天，給予腹腔注射生理鹽水，第15天開始給予生理鹽水霧化，給藥：每天霧化前2 h，各治療組予以對應藥物進行灌胃治療，正常組和哮喘模型組則將蒸餾水代替藥物，連續灌胃20 d。除正常組外，所有大鼠在行為學觀察中出現了氣促、抓鼻子、點頭、喜歡蜷縮、腹部可見痙攣甚至出現走路不穩等癥狀，說明大鼠哮喘模型制作成功。

2.4.3 標本采集 (1)血清：灌胃及霧化20 d結束后，配置2%戊巴比妥鈉麻醉劑麻醉各組大鼠，取5 mL的腹主動脈血于采血管中，靜置30 min離心后保存血清，用于檢測各組IL-5、CysLTs的情況。(2)肺葉：采完血后迅速摘取兩肺，用生理鹽水清洗干凈，一側肺組織固定于提前配置好的4%多聚甲醛溶液中，顯微鏡下觀察病理情況；將另一側的肺組織保存在-80 ℃ 的冰箱中，測定肺葉中CysLTR1mRNA、Eot-3 mRNA的表達水平。

2.4.4 肺組織切片制作 (1)脫水：依次放置以下濃度梯度的乙醇進行脫水：70%→80%→90%→95%→100%→100%各1 h[7]。(2)透明：脫完水的肺組織置于二甲苯中約10 min，可以看出肺組織顏色變為透明。 (3)包埋：用溶化的石蠟將肺組織包埋于包埋盒中。 (4)切片：用切片機將組織切成厚度為4 μm的切片。(5)貼片：將切好的片加熱熨燙后，粘到載玻片上并烘干水分，溫度控制在45 ℃左右。(6)染色：脫蠟(二甲苯I 、II 各10 min)→水化(100%→100%→95%→90%→80%→70%乙醇各1 min，清水洗3 min)→蘇木精染色5 min→流水沖2 min→1%鹽酸乙醇分化液20 s→流水沖 5 min(變藍)→蒸餾水洗 1 min→伊紅染色3 min→流水沖30 s→脫水(80%、90%、95%、100% 乙醇各2 min)→透明(二甲苯I 、II 、Ⅲ各2 min)。(7)封片：使用中性樹膠進行固定封片，最好標記，自然晾干。

2.4.5 血清中IL-5、CysLTs的檢測 按照試劑盒上的說明進行操作，所有流程包括：(1)稀釋→(2)加樣→(3)加酶→(4)溫育→(5)配液→(6)洗滌→(7)顯色→(7)終止反應→(9)測定。

2.4.6 肺組織中CysLTR1和Eot-3的mRNA表達水平檢測 (1)提取肺組織總RNA：勻漿管中加入Trizol Reagent預冷→放入100 mg肺組織→研磨→離心→加入250 mL三氯甲烷→靜置3 min→離心→取上清新的EP管→加入異丙醇→混勻→-20 ℃環境靜置15 min →離心→倒掉上清→75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀→離心→超凈臺上吹3 min→加入無RNA酶的水稀釋RNA→干燥RNA至乙醇完全揮發→加入DNase水溶解沉淀→OD值測定。(2)反轉錄：PCR管中加入10mLRNA→加入1 mL Oligo dT Primer →加入無核糖核酸酶的去離子水→PCR儀上65 ℃保溫5 min→冰上冷卻5 min→置于RNase PCR管中→加入4 mL 的5X Reaction Buffer、1 mL的Ribolock RNase Inhibitor、1 mL的ReverAid M-Mulv RT、2 mL的10mM dNTP Mix混合后放入65 ℃水浴中 →冰上冷卻5 min。(3)實時定量PCR。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠一般情況

正常組大鼠從實驗第1天到實驗最后1天一般情況良好，活動自由，精神狀態良好，毛發發亮，飲食正常，口咽、鼻腔無分泌物，無氣促、打噴嚏。哮喘模型組和其余各治療組大鼠均在第7天開始出現精神狀態較正常組差，到實驗第14天，精神狀態差更為明顯。霧化激發后可見呼吸急促、抓鼻子、動作不靈活、腹部出現痙攣、喜歡蜷縮、皮毛不光滑等，明顯較正常組差，隨著癥狀的加重，飲食的攝入量也隨之減少。哮喘模型組在造模前和取材時體重減輕，正常組增加，體重變化有顯著差異。3個治療組進行20天的給藥治療后，癥狀較哮喘模型組來說有明顯改善[8]。各組大鼠體質量變化：正常組和3個治療組大鼠前后體質量變化都比哮喘模型組的變化明顯(P<0.05)，其中穿山龍合孟魯司特鈉組的體質量變化最為明顯。表1。

表1 各組體質量前后變化情況

3.2 肺組織HE染色病理情況

正常組：偶見少量的嗜酸性粒細胞圍繞在氣道和血管周圍，支氣管腔光滑，氣道黏膜不可見，上皮結構完整，肺泡無異常。見圖1。

圖1 正常組

哮喘模型組：不僅在血管周圍的組織中可見大量炎性細胞，在環繞肺泡壁周圍也可見明顯的炎性細胞；而且氣道周圍的血管有明顯的擴張充血情況，支氣管和細支氣管的管腔較為狹窄，有明顯的上皮細胞增生，可見增厚的平滑肌，肺間質充血水腫明顯，見圖2。

圖2 哮喘哮喘模型組 100×

其余3組：經治療，肺泡內炎性細胞明顯少于哮喘模型組，可見輕微的支氣管黏膜水腫，支氣管壁內外的炎性細胞情況明顯比哮喘模型組好轉，其中穿山龍合孟魯斯特鈉組大鼠肺組織病理表現更接近正常組。見圖3、圖4、圖5。

圖3 穿山龍組

圖4 孟魯司特鈉組

圖5 穿山龍合孟魯司特鈉組

3.3 各組血清中IL-5、CysLTs水平

哮喘模型組血清中的IL-5、CysLTs水平相較正常組而言，明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；3個治療組的血清中IL-5、CysLTs水平較哮喘模型明顯降低 (P<0.05)；穿山龍合孟魯司特鈉組的相應指標水平比孟魯司特鈉組明顯降低(P<0.05)，穿山龍組和孟魯司特鈉組中的IL-5水平無明顯差異(P>0.05)；而穿山龍組和孟魯司特鈉組中的CysLTs水平比較，穿山龍組明顯低于孟魯司特鈉組(P<0.05)，說明穿山龍降低IL-5水平的效果與孟魯司特鈉相當，但降低CysLTs水平的效果雖然不及孟魯司特鈉，但與孟魯司特鈉合用可以增強孟魯司特鈉的效果。見表2。

表2 各組血清中IL-5、CysLTs水平測定

3.4 肺組織中CysLTR1mRNA、Eot-3 mRNA表達水平

3.4.1 Eot-3mRNA表達水平 哮喘模型組的Eot-3mRNA表達水平與正常組相比，有明顯升高(P<0.05)；3個治療組中的Eot-3mRNA表達水平相對于哮喘模型組來說，明顯降低，(P<0.05)；穿山龍合孟魯司特鈉組的Eot-3mRNA表達水平明顯低于孟魯司特鈉組(P<0.05)，說明穿山龍可降低哮喘大鼠Eot-3mRNA的表達水平，并且與孟魯司特鈉合用，效果更好。見表3。

表3 各組Eot-3mRNA表達水平檢測

3.4.2 CysLTR1mRNA表達水平 正常組中CysLTR1mRNA表達水平與哮喘模型組相比明顯降低(P<0.05)；3個治療組的CysLTR1mRNA表達水平低于哮喘模型組(P<0.05)；孟魯司特鈉組的水平明顯低于穿山龍組(P<0.05)；與孟魯司特鈉組比較，穿山龍合孟魯司特鈉組的水平較低 (P<0.05)，說明穿山龍可降低哮喘大鼠CysLTR1mRNA的表達水平，并且可增加孟魯司特鈉的效果。見表4。

表4 各組CysLTR1mRNA表達水平檢測

4 討論

氣道的慢性炎癥是哮喘發病的根本，也就是說，無論是什么程度或類型的哮喘，氣道的基本病理離不開炎癥，炎癥是引起哮喘氣道高反應、造成氣道的通氣障礙并引發臨床癥狀的關鍵因素[9]。根據文獻報道，穿山龍不僅能促使嗜酸性粒細胞(Eos)凋亡，而且可調節Th1/Th2的平衡，從而消除氣道炎癥[10-12]。本實驗通過對中藥穿山龍與西藥孟魯司特鈉作對比，經過數據分析，發現穿山龍可改善哮喘大鼠肺組織病理學狀態，減輕氣道中炎性細胞的浸潤程度，通過對血清中IL-5、CysLTs的檢測，發現穿山龍可在不同程度上降低IL-5、CysLTs水平，雖然穿山龍降低CysLTs水平的能力與孟魯司特鈉有明顯差距，但是穿山龍與孟魯司特鈉合用，效果顯著；并且二者合用還能降低哮喘大鼠肺組織中的CysLTR1mRNA、Eot-3mRNA表達水平，顯示穿山龍能增強白孟魯司特鈉的抗炎抗喘作用。