基于外觀特征量化結合內在質量指標的玄參藥材綜合質量評價

梁麗金，邱彩月，鄧怡芳，徐 杰，鐘文峰，孫冬梅，黃 瑤，莫秋怡

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

玄參為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl的干燥根，是著名的“浙八味”之一，主要分布于浙江、湖北、湖南、安徽、四川、云南等地，其中浙江為玄參的道地產區[1]。玄參產地加工過程中涉及反復干燥、堆積發汗等復雜工序，與其療效及顏色有關的環烯醚萜苷類成分(桃葉珊瑚苷等)的含量受產地加工的影響較大，因而導致市場上流通的玄參藥材良莠不齊、質量不均，影響臨床用藥的安全性和有效性[2-3]。目前，對于玄參藥材質量的劃分，多以傳統外觀性狀(如粗細、大小、斷面顏色等)鑒別或化學成分含量(哈巴苷、哈巴俄苷等)等指標作為評判標準[4-6]?；谥嗅t用藥整體性和玄參成分復雜性的特點，僅靠單一類型指標評價并不能全面客觀評價中藥質量，此外對性狀相似玄參藥材質量也難以準確評價。因此，有必要建立一種科學、合理的實現多種不同類型指標的綜合質量評價方法，以規范市場玄參藥材的質量控制。灰色關聯度法、逼近理想解排序法(TOPSIS法)均可以將多維問題轉化為一維問題，降低不同類型指標對決策的干擾，實現多指標綜合決策分析，評價結果更為客觀、合理，近年來在中藥材質量評價領域應用廣泛[7-10]。本研究擬采用MatLab圖像處理技術對玄參大小、顏色等外觀性狀進行量化，以性狀量化值及特征圖譜作為評價指標，并采用灰色關聯度法和熵權TOPSIS法對不同批次玄參藥材進行綜合評價，判斷不同批次玄參藥材質量情況，為玄參藥材質量評價與控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；MiliQ Direct 8型超純水機(默克密理博公司)；ME204E型萬分之一天平(Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)。

1.2 材料

哈巴苷(批號：111729-201707，純度96.8%)、毛蕊花糖苷(批號：111530-201914，純度95.2%)、哈巴俄苷(批號：111730-201508，純度96.0%)、桃葉珊瑚苷(批號：111761-200601，純度100%)、肉桂酸(批號：1110786-201604，純度98.8%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，色譜純乙腈(默克公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。11批玄參藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl的干燥根。來源信息見表1。

表1 玄參樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 特征圖譜建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL50%甲醇，稱重，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，冷卻補重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含桃葉珊瑚苷20 μg、毛蕊花糖苷20 μg、哈巴苷60 μg、哈巴俄苷60 μg、肉桂酸20 μg的溶液，作為混合對照品參照物溶液。

2.1.3 色譜條件 采用YMC Triart C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～5 min，0%～10% A；5～7 min；10%～20% A；7～9 min，20%～33% A；9～12 min，33% A；12～16 min，33%～60% A；16～24 min；60%～95% A；柱溫30 ℃；檢測波長：0～13.5 min為210 nm，13.5 min后改為278 nm；流速0.3 mL/min，進樣量1 μL。

2.1.4 方法學考察 (1)精密度考察。取玄參樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，連續進樣6次，以哈巴俄苷色譜峰為參照峰(S)，計算得到各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

(2)重復性考察。取玄參樣品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以哈巴俄苷色譜峰為參照峰(S)，計算得到各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3%，表明該方法重復性良好。

(3)穩定性考察。取玄參樣品，按“2.1.1”項下色譜條件，分別在樣品制備后的0、3、7、12、18、24 h進樣檢測，以哈巴俄苷色譜峰為參照峰(S)，計算得到各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 特征圖譜建立及共有峰確定 取11批玄參樣品，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件進行測定，記錄各特征峰的峰面積，并進行峰面積的歸一化處理，結果見表2。將各批次玄參特征圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”軟件進行處理，建立玄參對照特征圖譜，計算相似度結果見圖1和表3，發現不同批次樣品相似度均較高。11批玄參與對照指紋圖譜的相似度均大于0.90，表明建立特征圖譜檢測方法適應性良好，符合研究要求。建立特征圖譜標定11個共有峰，通過對照品比對，對桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、肉桂酸色譜峰進行指認，結果見圖2。

表2 各批次的特征圖譜共有峰的峰面積歸一化處理結果

表3 相似度評價

2.2 外觀圖像采集與藥材大小、顏色特征提取

每批藥材隨機抽取各11根，置白色紙上，相機與藥材保持15 cm距離，采集圖像。采用MatLab軟件自帶函數gb2gray、im2bw、bwlabel、regionprops等將藥材圖像轉化成二值圖像，提取并計算直徑、長短軸比、矩形度等形狀參數，并稱定每根玄參的質量。對預處理后玄參藥材圖像提取R(紅色)、G(綠色)、B(藍色)的均值，并將藥材圖像分別轉至HSV空間、Lab空間，提取H(色調)、S(飽和度)、V(亮度)、L*(明亮度)、a*(紅色到綠色范圍中位置)、b*(黃色到藍色范圍中位置)的均值。采用SPSS 20軟件對數據進行Kruskal -Wallis法檢驗，結果見表4、5。結果顯示S1～S6批次的玄參在外觀性狀特征和外部顏色色度值(H、V、L*、a*、b*、R、G、B)指標上兩兩之間均沒有差異，而只有S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11批次樣品主要分別在直徑、矩形度、圓形度、質量、色度值(H、S、V、L*、a*、b*、R、G、B)等單個或多個指標上與某些批次之間存在差異。

圖1 11批玄參UPLC特征圖譜

注：5：桃葉珊瑚苷；6：哈巴苷；7：毛蕊花糖苷；10：哈巴俄苷；11：肉桂酸。

表4 各批次玄參的外觀性狀特征測定結果

表5 各批次玄參的外部顏色色度值測定結果

2.3 熵權TOPSIS法分析

2.3.1 建立標準化決策矩陣 根據公式(1)，對原始數據進行高優同向化處理，建立標準化決策矩陣，并進行數據歸一化處理，其中m代表樣品，n代表指標，xij代表測量值。

(1)

2.3.2 各指標成分權重確定 根據公式(2)和(3)計算各指標的熵值和權重。得到熵值Ej=(0.903 1、0.887 3、0.925 4、0.869 0、0.914 7、0.907 3、0.926 4、0.928 3、0.939 2、0.931 3、0.921 4、0.903 5、0.863 5、0.858 0、0.826 2、0.902 7、0.848 5、0.840 0、0.829 1、0.925 1、0.920 9、0.911 8、0.920 7、0.923 1、0.942 9、0.885 5)；權重wj=(0.036 6、0.042 6、0.028 2、0.049 5、0.032 3、0.035 0、0.027 8、0.027 1、0.023 0、0.026 0、0.029 7、0.036 5、0.051 6、0.053 7、0.065 7、0.0368、0.057 3、0.060 5、0.064 6、0.028 3、0.029 9、0.033 4、0.030 0、0.029 1、0.021 6、0.043 3)。

(2)

(3)

Z=(Rij×wj)m×n

(4)

(5)

(6)

2.3.4 貼近度計算及評價 根據公式(7)，分別計算各評價對象與最優向量Z+和最劣向量Z-的距離D，根據公式(8)，計算各評價對象與最優方案的接近程度Ci，并進行排序，Ci越大表明越接近最佳方案。11批玄參質量評價排序結果見表6。熵權TOPSIS排序：S3>S4>S1>S11>S9>S6>S2>S5>S8>S7>S10。11批玄參綜合質量排名前3的為S1、S3、S4，說明S1、S3、S4的綜合質量較優；排名倒數3的為S7、S8、S10，說明S7、S8、S10的綜合質量較劣。同時，S1、S7的產地均為浙江，但S7的綜合質量排名為第10，說明相同產地的玄參綜合質量也存在較大的差異。

(7)

(8)

表6 熵權TOPSIS質量評價排序

2.4 灰色關聯度法分析

以各指標最大值建立理想參照材料；采用每列原始數據/列項均值進行無量綱化處理；計算均值化后各指標分別與對應的理想參照材料各指標的絕對差；并根據公式(9)計算關聯系數。關聯系數反映了待評指標與該指標理想值的吻合程度。關聯系數越大說明越接近該指標的理想值。其中i為待評樣本數(i= 0，1，2，…，m；m=11)，k為評價指標數(k= 0，1，2，…，n；n=26)。

(9)

根據公式(10)計算關聯度，并進行歸一化處理得各指標權重。得r(k)=(0.849 4、0.987 7、0.853 1、0.946 1、0.946 2、0.880 0、0.870 3、0.854 4、0.906 8、0.901 2、0.864 7、0.822 7、0.809 6、0.748 1、0.600 3、0.635 2、0.506 3、0.598 4、0.546 8、0.586 6、0.574 2、0.839 7、0.748 9、0.711 2、0.818 4、0.636 1)；ω(k)=(0.042 4、0.049 3、0.042 6、0.047 2、0.047 2、0.043 9、0.043 4、0.042 6、0.045 2、0.045 0、0.043 1、0.041 0、0.040 4、0.037 3、0.029 9、0.031 7、0.025 3、0.029 9、0.027 3、0.029 3、0.028 6、0.041 9、0.037 4、0.035 5、0.040 8、0.031 7)。

(10)

根據公式(11)計算灰色關聯度，并進行排序。結果見表7。灰色關聯度法綜合排序：S4>S1>S3>S9>S6>S11>S5>S2>S8>S7>S10；11批玄參綜合質量排名前3的為S1、S3、S4，說明S1、S3、S4的綜合質量較優；排名倒數3的為S7、S8、S10，說明S7、S8、S10的綜合質量較劣。這與熵權TOPSIS法分析結果一致。

(11)

表7 灰色關聯度法質量評價排序

3 討論

本研究采用灰色關聯度法和熵權TOPSIS法構建玄參兩種質量綜合評價模型，11批玄參藥材質量評價最優的均為S1、S3、S4，最劣的均為S7、S8、S10。采用灰色關聯度法與熵權TOPSIS法對11批玄參藥材進行綜合質量評價的排序結果基本一致，說明構建的灰色關聯度和熵權TOPSIS模型可以相互印證，可用于玄參藥材的綜合質量評價。古籍文獻均以浙江的玄參質量為最佳，本研究S1和S7均產自道地產區浙江，但綜合質量差別較大。由此可見，僅以傳統的眼觀、口嘗、鼻聞等鑒別手段或唯化學成分論評價，難以很好地區分玄參質量的優劣。

本研究建立玄參UPLC特征圖譜，與現有文獻報道的方法相比，制樣方法簡便、分析速度較快、分離效果較佳。共標定11個特征峰，并對桃葉珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、肉桂酸色譜峰進行了指認。其中桃葉珊瑚苷是玄參主要藥效成分，具有抗病毒、抗炎的藥理作用[11]；同時桃葉珊瑚苷為環烯醚萜苷類成分，在玄參加工炮制過程中，其結構的改變與玄參藥材顏色加深直接相關[12]。此外，哈巴苷、哈巴俄苷是《中國藥典》2020年版一部玄參含量測定項下的質量控制指標[13]。由此可知，本研究建立的UPLC特征圖譜所表征的化學成分，作為玄參內在質量指標具有顯著代表性。

目前，中藥質量評價模式主要有傳統經驗評價、單一指標或多指標成分評價、指紋圖譜或者特征圖譜評價等。本文在繼承傳統鑒定基礎上對外觀性狀大小和顏色進行定量表征，解決了傳統經驗存在主觀性強的問題，并結合能反映中藥材整體化學成分的特征圖譜作為評價指標，通過灰色關聯度法和熵權TOPSIS法進行質量綜合評價，可以解決中藥質量評價時多指標評價標準不統一的問題和排除主觀賦權對結果的影響，從而更加全面地從外在性狀到內在質量層面上客觀反映玄參質量，這與中藥多指標質量綜合評價思路相吻合。本方法分析科學、合理、可靠，可為玄參的質量評價及全面質量控制提供參考。