基于miRNA-mRNA 探討西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及預(yù)后分析

鄧顯光，劉麗芳，袁 博*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺科，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

乳腺癌是全球第一大惡性腫瘤，發(fā)病率11.7%，死亡率6.9%，嚴(yán)重危害女性生命健康[1]。晚期乳腺癌患者中65%～75%發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，常伴有骨痛、骨相關(guān)事件、骨損傷等，治療上以控制腫瘤進(jìn)展、緩解疼痛、改善生活質(zhì)量為原則，在化學(xué)藥物治療、內(nèi)分泌治療、靶向治療、免疫治療等多學(xué)科綜合治療控制乳腺癌原發(fā)灶的基礎(chǔ)上，加用雙磷酸鹽、地舒單抗等骨改良藥物，治療骨相關(guān)事件[2]。 在整體觀念、辨證論治理論指導(dǎo)下，中醫(yī)藥治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用，可有效提高乳腺癌患者生存率及生活質(zhì)量，中西醫(yī)結(jié)合方案具有協(xié)同增益的效用[3]。西黃丸作為廣譜抗腫瘤中成藥，聯(lián)合唑來(lái)膦酸能顯著提高乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的臨床療效及生存質(zhì)量[4]。 研究表明，miRNA 對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移有著重要作用[5]，且miRNA 可作為乳腺癌治療以及生存預(yù)后的生物標(biāo)志物[6]。 miRNA-556-5p 能與靶基因3'UTR相結(jié)合，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著調(diào)控作用[7]。 為進(jìn)一步明確乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，本研究以西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移為切入點(diǎn)，以miRNA-mRNA 互作為落腳點(diǎn)，綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)的方法，明晰西黃丸治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及藥物干預(yù)靶點(diǎn)，為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的藥物干預(yù)靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物的確定提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移miRNA-mRNA 互作關(guān)系構(gòu)建

通過(guò)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），分別獲取GPL21572 探針的乳腺癌miRNA（GSE143564）與GPL570 探針的基因（GSE42568）表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)。 GSE143564 表達(dá)矩陣中，將GSM 4262013～GSM4262015 樣本分為正常組（Normal 組），GSM4262016～GSM4262018樣本分為乳腺癌組（Tumor組）；GSE42568 表達(dá)矩陣中，將GSM1045191～GSM 1045207樣本分為正常組（Normal 組），GSM1045208～GSM1045311 分為乳腺癌組（Tumor 組）。 采用R 語(yǔ)言“l(fā)imma”包，以log2FC＞1 或log2FC＜-1，且P＜0.05為 篩 選條件[8]，差異分析GSE143564、GSE42568 表達(dá)矩陣，分別篩選出差異miRNA（differentially expressed microRNAs, DEMs）與差異基因（differentially expressed genes, DEGs），繪制DEMs 環(huán)形聚類熱圖、DEGs 火山圖與前20 位DEGs 熱圖（基于log2FC 絕對(duì)值）。

通過(guò)TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.targetscan.org/vert_80/），逐一檢索DEMs 靶基因（differentially expressed microRNA target genes, DEMTGs），構(gòu)建DEMs-DEMTGs 映射關(guān)系。

通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/），以“bone metastasis”為檢索詞，獲取骨轉(zhuǎn)移基因（bone metastasis genes, BMGs）。

通過(guò)TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、TCMID（http://47.100.169.139/tcmid/search/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取西黃丸中牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥的有效組分。 通過(guò)PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取西黃丸各有效組分SMILES 號(hào)或結(jié)構(gòu)式。 通過(guò)SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取西黃丸潛在藥物靶點(diǎn)（Xi Huang Wan Genes, XHWGs）。

通過(guò)在線韋恩圖工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取DEGs、DEMTGs、BMGs、XHWGs 4 個(gè)分子靶點(diǎn)交集，獲取西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)。

通過(guò)DEMs-DEMTGs 映射關(guān)系，映射西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)的上游DEMs，采用Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建miRNA-mRNA 互作關(guān)系。

1.2 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因篩選及富集分析

通過(guò)STRING（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，獲取西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape 3.8.2 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，使用CytoHubba 中MCC 算法對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯@取西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因。 采用R 語(yǔ)言“clusterProfiler”包對(duì)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology, GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）富集分析。根據(jù)DEMs-DEMTGs映射關(guān)系，采用Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因miRNA-mRNA 核心網(wǎng)絡(luò)。

1.3 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因表達(dá)差異分析及數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

采用R 語(yǔ)言，以TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺浸潤(rùn)癌患者RNAseq 數(shù)據(jù)及臨床信息作為驗(yàn)證集， 取1109 例乳腺浸潤(rùn)癌患者RNAseq數(shù)據(jù)與113 例癌旁樣本RNAseq 數(shù)據(jù)進(jìn)行非配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)，將113 例癌旁組織作為正常組，113 例癌旁組織對(duì)應(yīng)的乳腺癌組織作為腫瘤組，進(jìn)行配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)，以驗(yàn)證西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因的表達(dá)。

通過(guò)HPA（https://www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因的相對(duì)表達(dá)免疫組化結(jié)果。

1.4 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)預(yù)后分析

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用R 語(yǔ)言“glmnet”“survival”包對(duì)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)進(jìn)行Lasso 回歸分析，十折交叉驗(yàn)證法篩選Lasso 的值，構(gòu)建系數(shù)篩選圖與變量軌跡圖。

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用R 語(yǔ)言“survminer”“survival”包，Kaplan-Meier 曲線參數(shù)法構(gòu)建分子靶點(diǎn)與患者總體生存期（overall survival, OS）的生存曲線，評(píng)判分子靶點(diǎn)高、低表達(dá)在乳腺癌中的生存預(yù)后價(jià)值；采用R 語(yǔ)言“pROC”包構(gòu)建受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC），分析Lasso 回歸篩選后的西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)的表達(dá)的診斷價(jià)值。

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用R 語(yǔ)言構(gòu)建西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)的表達(dá)與Hub 基因之間的相關(guān)性，將分子靶點(diǎn)表達(dá)量的中位數(shù)作為截?cái)嘀担譃楦摺?低表達(dá)組， 將Hub 基因的表達(dá)量進(jìn)行Zscore 轉(zhuǎn)換，Zscore=（表達(dá)量-均值）/標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行熱圖可視化。

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，以臨床TNM 分期、年齡、病理階段、分子靶點(diǎn)表達(dá)為自變量，以生存預(yù)后為因變量，采用R 語(yǔ)言單因素Cox 回歸分析得到風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio, HR），構(gòu)建臨床信息與分子靶點(diǎn)預(yù)后模型，HR＞1 為危險(xiǎn)因素，HR＜1 為保護(hù)因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用非配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)對(duì)ADRB1 相關(guān)的miRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析，符合正態(tài)性和方差齊性時(shí)采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；僅符合正態(tài)性而不滿足方差齊性時(shí)采用Weltch t 檢驗(yàn)；均不滿足正態(tài)性時(shí)采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。采用R 語(yǔ)言“pROC”包構(gòu)建ROC 曲線，分析ADRB1 相關(guān)差異表達(dá)的miRNA 的診斷價(jià)值。 采用R 語(yǔ)言“rms”包對(duì)ADRB1 相關(guān)差異表達(dá)的miRNA 構(gòu)建列線圖，設(shè)置標(biāo)尺評(píng)分來(lái)表征各個(gè)miRNA 的表達(dá)情況，計(jì)算總評(píng)分預(yù)測(cè)OS 生存預(yù)后的概率。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移miRNA-mRNA 互作關(guān)系

以GPL570 為探針的GSE42568 芯片差異分析出3364 個(gè)DEGs，其中1689 個(gè)在乳腺癌中高表達(dá)，1675 個(gè)在乳腺癌中低表達(dá)（圖1A）。 根據(jù)差異倍數(shù)log2FC 的值，分別將高表達(dá)、低表達(dá)前20 位DEGs可視化并進(jìn)行歐式聚類，KRT19、COL11A1、EPCAM等在乳腺中高表達(dá)，LEP、RBP4、ADH1B 等在乳腺癌中低表達(dá)（圖1B）。以GPL21572 為探針的GSE143564芯片差異分析出159 個(gè)DEMs，其中140 個(gè)（miR-182、miR-494-3p、miR-3651 等）在乳腺癌中高表達(dá)，19個(gè)（miR-6722、miR-6732-5p、miR-8057 等）在乳腺癌中低表達(dá)，并將其歐式聚類及環(huán)形可視化（圖1C）。

通過(guò)TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)，共構(gòu)建了353 583 組DEMs-DEMTGs 映射關(guān)系；通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲取8690 個(gè)BMGs；通過(guò)TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取牛黃有效組分（脫氧膽酸、甲基脫氧膽酸等）共5 個(gè)、麝香有效組分（17-β-雌二醇、麝香醇、尿囊素等）共59 個(gè)、乳香有效組分（α-乳香酸、3-羥基甘遂酸、因香酚等）共8 個(gè)、沒(méi)藥有效組分（逆沒(méi)食子酸、天竺葵素、植物類固醇Ⅳ等）共45 個(gè)，進(jìn)一步通過(guò)SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲取644個(gè)XHWGs；取DEGs、DEMTGs、BMGs、XHWGs交 集，共獲取135 個(gè)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)（圖1D）。

采用Cytoscape 3.8.2 對(duì)135 個(gè)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)構(gòu)建miRNA-mRNA 互作關(guān)系，135 個(gè)分子靶點(diǎn)與196 個(gè)miRNA 構(gòu)建出2964組miRNA-mRNA 互作關(guān)系。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移miRNA-mRNA 互作關(guān)系

2.2 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因篩選及GO、KEGG 富集分析

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)中，共有135 個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白，構(gòu)成666 組PPI 關(guān)系（P＜0.01）。PPI 網(wǎng)絡(luò)初步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR、IL-6、PPARG 蛋白Degree 值最大，相互作用最強(qiáng)（圖3A）。 MCC 算法拓?fù)浞治龊Y選出前10 位作為Hub 基因，分別為CCL2、SIRT1、EGFR、PPARG、IL-6、CASP1、PTGS2、MMP-9、BCL2L1、ESR1，并進(jìn)行可視化（圖3B）。 GO、KEGG 共富集出1589個(gè)生物進(jìn)程（biological process, BP）、26 個(gè)細(xì)胞組分（cell component, CC）、133 個(gè) 分 子 功 能（molecular function, MF）、112 個(gè)KEGG 通路，其中西黃丸治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與其影響膜上受體蛋白的蛋白酪氨酸激酶活性、激活MAPK 信號(hào)通路、參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)代謝等生命進(jìn)程有關(guān)（圖3C）。 采用Cytoscape 3.8.2 對(duì)10 個(gè)Hub 基因構(gòu)建miRNAmRNA 核心網(wǎng)絡(luò)，10 個(gè)Hub 基因與95 個(gè)miRNA 構(gòu)建出175 組miRNA-mRNA 核心互作關(guān)系（圖3D）。

圖3 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因及GO、KEGG 富集分析結(jié)果

2.3 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因表達(dá)差異及數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證結(jié)果

以TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)為驗(yàn)證集，非配對(duì)與配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖4A、B）：西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub基因中，CCL2、SIRT1、EGFR、PPARG、IL-6、CASP1、PTGS2 在乳腺癌中低表達(dá)；MMP-9、BCL2L1、ESR1在乳腺癌樣本中高表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)比較乳腺癌患者中10 個(gè)Hub 基因免疫組化的相對(duì)高、低表達(dá)的結(jié)果（圖4C），此結(jié)果與GSE42568 差異分析結(jié)果相互佐證。

圖4 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因表達(dá)及HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證結(jié)果

2.4 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)預(yù)后分析結(jié)果

將135 個(gè)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)納入Lasso 回歸分析中，構(gòu)建系數(shù)篩選圖與變量軌跡圖（圖5A、B）對(duì)其進(jìn)行降維處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)中，ADRB1 可作為乳腺癌獨(dú)立預(yù)后因子。 非配對(duì)與配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖5C、D），ADRB1 在乳腺癌患者組織中低表達(dá)；Kaplan-Meier 曲線（圖5E）顯示，ADRB1 高表達(dá)組具有較好的生存預(yù)后（P＜0.05）；ROC 曲線（圖5F）顯示，ADRB1 在患者診斷中具有較高的診斷性（AUC=0.854，95%CI=0.826～0.882）。 進(jìn) 一 步 分 析ADRB1 與10 個(gè)Hub 基因表達(dá)的相關(guān)性并繪制相關(guān)性表達(dá)熱圖（圖5G），發(fā)現(xiàn)ADRB1 與CCL2、EGFR、PPARG、IL-6、CASP1、PTGS2 表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01）；ADRB1與BCL2L1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

圖5 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)預(yù)后分析

通過(guò)單因素Cox 分析評(píng)估ADRB1 表達(dá)及患者多種臨床特征（圖6），發(fā)現(xiàn)在TCGA 乳腺癌患者中，T4分期、N 分期（N1、N2、N3）、M 分期、年齡、病理階段（Stage Ⅲ、Stage Ⅳ）、ADRB1 高表達(dá)與患者OS 顯著相關(guān)（P＜0.05），進(jìn)一步多因素Cox 分析發(fā)現(xiàn)M 分期為危險(xiǎn)因素（P＜0.05）、年齡為危險(xiǎn)因素（P＜0.001）、ADRB1 高表達(dá)為保護(hù)因素（P＜0.05），與患者OS 顯著相關(guān)。

圖6 ADRB1 表達(dá)與多個(gè)臨床特征的單因素Cox 回歸分析森林圖

2.5 ADRB1 相關(guān)miRNA 差異表達(dá)、診斷及預(yù)后列線圖結(jié)果

通過(guò)“1.1”構(gòu)建的DEMs-DEMTGs 映射關(guān)系，映射出與ADRB1 相關(guān)的miRNA 共12 個(gè)，分別為hsamiR-500a-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-4665-5p、hsa-miR-3615、hsa-miR-4436b-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-183-3p、hsa-miR-320e。 再通過(guò)非配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn) （圖7A），hsamiR-500a-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-4665-5p、hsa-miR-3615、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-183-3p 在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)（P＜0.001），而hsa-miR-1246、hsa-miR-4436b-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-320e 在乳腺癌與正常組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

對(duì)上述8 個(gè)差異表達(dá)的miRNA 構(gòu)建診斷ROC曲線（圖7B），發(fā)現(xiàn)均具有診斷價(jià)值，可作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物（P＜0.05），其中AUC 由高到低排序依次為：hsa-miR-141-3p＞hsa-miR-183-3p＞hsa-miR-629-3p＞hsa-let-7d-5p＞hsa-miR-93-3p＞hsa-miR-3615＞hsa-miR-4665-5p＞hsa-miR-500a-5p；0.5≤AUC＜0.7 為較低準(zhǔn)確性，0.7≤AUC＜0.9 為中度準(zhǔn)確性，0.9≤AUC 為高度準(zhǔn)確性。

對(duì)上述8 個(gè)差異表達(dá)的miRNA 構(gòu)建列線圖（圖7C），差異表達(dá)miRNA 可用來(lái)預(yù)測(cè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者1、2、3 年生存預(yù)后，此預(yù)測(cè)模型的一致性指數(shù)Cindex 為0.588（0.556～0.619）。

圖7 ADRB1 相關(guān)miRNA 差異表達(dá)、診斷及預(yù)后列線圖結(jié)果

3 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移屬于中醫(yī)學(xué)“骨瘤”“頑痹”“骨蝕”等范疇[10]。正氣不足，髓不充骨，癌邪乘虛侵襲入骨，氣、血、痰、毒、濕邪蘊(yùn)積搏結(jié)于局部，且久郁化火，阻滯氣血津液運(yùn)行，搏結(jié)傷骨發(fā)而為瘤[11]。且乳腺癌骨轉(zhuǎn)移多伴有骨痛，其病性證素多為氣滯、血瘀[12]。 西黃丸由牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥組成，方中牛黃清熱解毒、消腫化痰，麝香活血散瘀、消腫止痛，二者配伍，一寒一溫，共奏透邪行氣化瘀之功；佐以乳香、沒(méi)藥?kù)钚胺稣⑾[止痛、調(diào)氣活血，四藥合用，共奏軟堅(jiān)散結(jié)、清熱解毒、散瘀止痛之效[13]。研究發(fā)現(xiàn)，西黃丸主要活性成分有五環(huán)三萜類（如乳香酸類）、揮發(fā)油類、甾體類（如豬去氧膽酸），均具有抗腫瘤的作用[14]，且西黃丸還有改變?nèi)橄侔┑哪[瘤炎癥微環(huán)境的作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，西黃丸聯(lián)合唑來(lái)膦酸治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移總有效率為82.5%，能有效提高機(jī)體免疫及骨質(zhì)修復(fù)能力，改善生活質(zhì)量[4]。 SINGH 等[16]發(fā)現(xiàn)miRNAs直接參與了骨組織中乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移；CAI 等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-124 被抑制可促進(jìn)體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移，且在乳腺癌轉(zhuǎn)移性骨組織中miR-124 顯著減少；FENG 等[18]發(fā)現(xiàn)miR-124 過(guò)表達(dá)可抑制破骨細(xì)胞生成，從而抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。在西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移明顯有效的背景下，以miRNA-mRNA 相互作用為模式，進(jìn)一步尋找乳腺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物、驅(qū)動(dòng)基因及藥物干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。

本研究采用生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)西黃丸中脫氧膽酸、麝香醇、α-乳香酸、逆沒(méi)食子酸等多個(gè)有效組分，共同調(diào)控EGFR、IL-6、PPARG等135 個(gè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)。 西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與干預(yù)膜上受體蛋白的蛋白酪氨酸激酶活性、激活MAPK 信號(hào)通路以及參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)代謝等生命進(jìn)程有關(guān)。同時(shí)，本研究構(gòu)建了135 個(gè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移分子靶點(diǎn)與196 個(gè)乳腺癌差異miRNA 交互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建出2964組miRNA-mRNA 互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，錨定了10 個(gè)Hub 基因與95 個(gè)miRNA，構(gòu)建出175 組miRNA-mRNA 核心互作關(guān)系，為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志的篩選提供了依據(jù)。KIM 等[19]研究發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2 通過(guò)PPARG 非依賴性途徑，在胞內(nèi)抑制RANKL 表達(dá)及活性，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和乳腺癌小鼠骨小梁的破壞。

在TCGA 中驗(yàn)證Hub 基因差異表達(dá)及臨床相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移Hub 基因中，CCL2、SIRT1、EGFR、PPARG、IL-6、CASP1、PTGS2在乳腺癌樣本中低表達(dá)；MMP-9、BCL2L1、ESR1 在乳腺癌樣本中高表達(dá)，與差異分析結(jié)果和免疫組化結(jié)果相互佐證。 Lasso 回歸分析聚焦出ADRB1 是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子，具有良好的診斷價(jià)值及生存預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，且與CCL2、EGFR、PPARG、IL-6、CASP1、PTGS2 表達(dá)呈正相關(guān)；ADRB1 與BCL2L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的M 分期、年齡是主要危險(xiǎn)因素，而ADRB1高表達(dá)為保護(hù)因素，三者與患者OS 顯著相關(guān)。 WANG等[20]通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)乳腺癌腫瘤突變負(fù)荷和免疫浸潤(rùn)進(jìn)行分析，鑒定出ADRB1 是乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物，但是ADRB1 在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中尚無(wú)報(bào)道，且未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果。 基于此，認(rèn)為ADRB1 可能是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的有效藥物干預(yù)靶點(diǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。

基于miRNA-mRNA 互作模式，聚焦ADRB1 的相關(guān)miRNA，進(jìn)一步尋找乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的miRNA生物標(biāo)志物，并構(gòu)建臨床預(yù)測(cè)模型列線圖，發(fā)現(xiàn)hsamiR-500a-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-4665-5p、hsa-miR-3615、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-183-3p 在乳腺癌組織中高表達(dá)，且AUC 均大于0.5，具有良好的診斷價(jià)值，并構(gòu)建了8 個(gè)miRNA 的列線圖（C-index=0.588），可認(rèn)為此8 個(gè)miRNA 可作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。KAWAGUCHI 等[21]綜合分析TCGA、GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，開(kāi)發(fā)了乳腺癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的miRNA 預(yù)測(cè)模型，其中包括has-miR-19a、has-miR-93 和has-miR-106a，與本研究構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型相互佐證。 基于此，本研究認(rèn)為基于8 個(gè)miRNA 開(kāi)發(fā)的預(yù)后模型，可預(yù)測(cè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的不良預(yù)后。

綜上所述，本研究基于miRNA-mRNA 互作模式，采用生物信息學(xué)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，綜合分析多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，闡述了西黃丸干預(yù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與其多組分調(diào)控ADRB1 等多靶點(diǎn)、介導(dǎo)MAPK 等多通路、參與多生物進(jìn)程有關(guān)，同時(shí)聚焦出8 個(gè)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移預(yù)后不良有關(guān)的miRNA，建立了預(yù)測(cè)模型，為開(kāi)發(fā)治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移藥物以及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物的確定提供了潛在價(jià)值，對(duì)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化推廣具有重要意義。