糖調節受損患者腸道菌群特征及高能量激光的干預作用探究

陳諾梅，陳海萍，成熟，李璇，孫錦文，張威

糖調節受損(impaired glucose regulation, IGR)也稱為糖尿病前期，包括空腹血糖受損和糖耐量受損，是2型糖尿病(diabetes mellitus type 2, T2DM)發生的早期事件。腸道菌群作為最大、最復雜的微生態系統，包含的微生物數量是人體細胞的近10倍[1]，與人體健康密切相關。多項研究證明糖調節受損及糖尿病患者腸道菌群發生紊亂[2-4]，腸道微生物結構變化導致腸壁屏障受損，進而引起體內慢性炎癥反應，加劇胰島素抵抗，從而參與糖尿病的發生發展過程[5-6]。

激光已廣泛用于疾病治療。根據采用的激光能量高低可分為低能量激光和高能量激光，低能量激光具有消炎止痛、改善循環、調節神經及免疫功能等作用[7-8]。高能量激光可通過生物刺激作用影響細胞微環境，增強細胞代謝，并降低前列腺素、c反應蛋白、白細胞介素1等水平，控制炎癥反應，高能量激光還具有脈沖發射、功率較大、組織穿透深等特點，可快速誘導組織深部光化學和光熱效應，從而治療深層組織和結構，同時還可通過調節脈沖強度和頻率來控制光熱效應，提高患者的安全性和舒適度[9-10]。激光已經在改善糖脂代謝、治療糖尿病視網膜病變、糖尿病周圍神經病變等方面取得了重大進展[11]，但對糖耐量異常患者腸道菌群的調節作用目前尚未見報道。本研究運用高能量激光輻照糖調節受損患者腹部，觀察輻照后患者腸道菌群的恢復情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年5月～2021年12月就診于武漢科技大學附屬華潤武鋼總醫院的糖調節受損患者13例作為觀察組。納入標準：糖調節受損診斷參照1999年世界衛生組織糖尿病專家委員會制定標準，患者經口服葡萄糖耐量試驗檢查提示6.1 mmol/L<空腹血糖<7.0 mmol/L或7.8 mmol/L<餐后2 h血糖<11.1 mmol/L；1個月內未使用任何降糖藥物、抗生素及質子泵抑制劑，無急性或慢性胃腸道疾病史；排除標準：有消化系統腫瘤或手術史；有心肝腎等嚴重器質性疾病，一般情況較差，嚴重營養不良；近4周有抗生素、益生元、益生菌、微生態活菌制劑等服用史；6個月內有創傷或手術史；妊娠婦女及哺乳期婦女；無法配合隨訪者。另收集我院健康體檢者10例為對照組，年齡≥18歲，無糖尿病或糖調節受損病史，無嚴重器質性疾病，無急性感染或慢性消化系統疾病史。實驗期間所有研究對象保持常規、清淡、規律飲食。本次研究通過華潤武鋼總醫院倫理委員會的批準，所有研究對象均詳細了解研究過程并簽署知情同意書。2組研究對象的年齡、性別、身體質量指數(body mass index, BMI)等一般資料比較差異無統計學意義。見表1。

1.2 方法 觀察組干預前記為A組，干預后記為B組，對照組記為H組。觀察組予以980nm半導體激光輻照腹部9個治療位點，療程1個月。高能激光發射器及治療方式 選用波長為980nm半導體激光設備(SAT-G30高能量半導體激光治療儀)，參數選擇：功率15w，脈沖7ms，頻率10Hz，選用點照式輻照方式輻照結腸體表投影9個點(如圖1所示)，圖1黃色圈圈代表的是腹股溝韌帶的中點，輔以定位激光輻照點。

表1 2組一般資料比較

圖1 激光輻照點圖示

激光發射探頭以按壓深度約2～3cm置于腹部9個輻照點上，單點單次輻照時間為60s，順時針方向依次進行。治療頻次為2～3次/周，共4周。

1.3 評定標準 提取觀察組干預前后及對照組大便菌群基因組DNA進行高通量測序。糞便樣本采集：于清晨空腹時分別采集觀察組干預前后及對照組受試者糞便樣本2～5g，置于滅菌糞便收集杯中，封口后立即保存于-80 ℃；糞便樣本檢測：DNA提取、擴增及測序 糞便樣本用干冰運輸至實驗室后，對各組糞便樣本用干冰運輸至武漢百齊生物技術有限公司進行檢測。對糞便中微生物總DNA進行提取并定量，針對細菌16SrRNA基因V3V4區，添加帶有barcode序列的特異物，利用引物序列(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)進行PCR擴增，對擴增產物進行磁珠純化回收、熒光定量(試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)，并制備測序文庫，采用Illumina MiSeq/NovaSeq平臺進行雙端測序，測序原始數據經過篩查合格后用Vsearch方法在97%相似水平上進行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類，進而得到物種分類學注釋，使用QIIME2軟件計算出Alpha多樣性指數(包括Chao1、Observed species、Shannon、Simpson)、繪制稀疏曲線，最終得到樣品的生物信息學結果，以上過程由武漢百齊生物技術有限公司完成。考慮到16SrRNA測序的特點，本研究將主要從門和屬水平以及ɑ多樣性方面對各樣本腸道菌群物種進行生物學信息分析。α多樣性反映的是單個樣品內部的物種多樣性，包括α多樣性指數和稀釋曲線。α多樣性指數以Chao1和Observed species指數表征豐富度，Pielou’s evenness指數表征均勻度，數值越大，說明豐富度和均勻度越高；以Shannon和Simpson指數表征多樣性，Shannon指數與物種多樣性呈正相關，Simpson指數與物種多樣性呈負相關。

2 結果

2.1 生物信息學分析 對3組共36份樣本進行細菌DNA提取及高通量測序后，切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，共獲得2216426份高質量序列，通過Vsearch軟件進行OTU聚類并繪制韋恩圖，3組樣本共獲得42519個OTU，其中3組共有的OTU有2228個(5.24%)，H組與A組共有2708個(6.37%)，A組與B組共有4599個(10.82%)。見圖2。

圖2 3組樣本OTU分布的韋恩圖

2.2 物種組成分析 將聚類得到每個OTU的代表序列與Greengene數據庫內置數據進行對比后，獲取各樣本在門、綱、目、科、屬、種6個分類學水平的注釋信息。

2.2.1 在門分類水平，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門是3組人群腸道菌群中的絕對優勢菌門。A組與H組的4個菌門相對豐度均無顯著差異，而B組與A組相比擬桿菌門相對豐度升高具有統計學差異(P<0.05)，變形菌門及放線菌門相對豐度降低，但豐度變化均未達到顯著水平。見表2。

表2 3組樣本門水平相對豐度比較 M (P25, P75)

2.2.2 在屬分類水平上，A組的梭菌屬、雙歧桿菌屬、志賀菌屬的相對豐度高于H組，而副桿菌屬、糞桿菌屬、鏈球菌屬的相對豐度低于H組，3組間具有顯著差異的是副桿菌屬和糞桿菌屬(P<0.05)。B組的梭菌屬、副桿菌屬、糞桿菌屬相對豐度較A組升高，其中副桿菌屬相對豐度變化具有顯著差異(P<0.05)，而雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、志賀菌屬較干預前降低，其中鏈球菌屬的差異具有統計學意義 (P<0.05)。見表3。

表3 3組樣本屬水平相對豐度比較 M (P25, P75)

2.3 α多樣性分析 所有樣本的測序覆蓋率均在97%以上，絕大多數樣本稀釋曲線趨于平緩，表明測序數據量足夠反映樣品中絕大多數的微生物物種信息，A組與H組的Chao1、Simpson指數曲線之間存在一定距離，而經激光治療后的B組與H組曲線接近重合，A組與H組在Shannon指數、Pielou’s evenness指數上的差異具有統計學意義(P<0.05)；A組在多樣性及均勻度上均顯著小于H組，A組的Chao1、Observed species、Simpson指數較H組降低，但差異無統計學意義；B組的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson、Pielou’s evenness指數均較A組顯著提高(P<0.05)，說明B組與A組比較在豐富度、多樣性及均勻度上均得到顯著提高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 樣本Chao1、Simpson指數結果

表4 3組樣本α多樣性指數比較

3 討論

本研究發現糖調節受損患者腸道內副桿菌屬相對豐度、糞桿菌屬相對豐度、物種多樣性及均勻度均明顯低于健康對照組，差異具有統計學意義。糖調節受損患者經激光干預后與干預前相比，擬桿菌門和副桿菌屬相對豐度、物種豐富度、多樣性及均勻度均顯著提高，鏈球菌屬相對豐度顯著下降。

腸道微生物群與人體自身的代謝緊密相連，基因測序技術的發展推動了人類關于代謝性疾病與腸道菌群之間關系的探索進程。腸道微生物群可以通過水解發酵食物中的多糖促進代謝并產生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFAs)，SCFAs主要由乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽組成，在腸道細胞增殖、肥胖整體調控、維持腸道微生態平衡以及提高宿主免疫力中起重要作用。擬桿菌門主要產生乙酸鹽和丙酸鹽，厚壁菌門產生丁酸鹽，放線菌門的某些種屬可產生乙酸鹽和丁酸鹽，研究發現厚壁菌門豐度與T2DM呈負相關[12-13]，擬桿菌門豐度降低與肥胖有關[14]，放線菌門與T2DM呈負相關，且患者體內致病菌志賀菌存在富集現象[15-17]，而與之結論相反的另一項研究則發現糖尿病前期和T2DM患者腸道內放線菌門豐度增加[18]，變形菌門為革蘭氏陰性菌，其外膜成分脂多糖可促進內毒素血癥、加重炎癥反應。本研究發現與對照組相比，干預前觀察組變形菌門相對豐度較高，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門相對豐度較低，經過激光干預之后，擬桿菌門相對豐度顯著提高，厚壁菌門較干預前升高，變形菌門較前下降，但差異不具有統計學意義，考慮與本研究樣本量較小有關，仍需進行大樣本隨機對照研究進一步驗證。

此外，T2DM患者腸道內雙歧桿菌屬、糞桿菌屬含量下降，雙歧桿菌和梭菌含量與血糖水平呈負相關[19-23]。Allin等[24]研究發現糖尿病前期患者腸道梭菌屬下降，鏈球菌屬上升，另一研究卻發現鏈球菌屬的相對豐度從血糖正常人群到糖尿病前期再到T2DM患者呈逐漸持續下降趨勢[25]。糖調節受損是糖代謝正常向糖尿病發展的關鍵階段，目前關于糖調節受損患者腸道菌群變化的研究較少。本研究顯示糖調節受損患者腸道菌群中的擬桿菌門豐度降低，副桿菌屬和糞桿菌屬相對豐度降低。α多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標。Alpha多樣性主要與兩個因素有關：一是種類數目，即豐富度，主要包括Chao指數、Ace指數、Observed species；二是多樣性，群落中個體分配上的均勻性，主要包括Shannon指數、Simpson指數和Pielou’s evenness指數。有研究顯示α多樣性在糖尿病患者中是降低的[26]，且與糖代謝紊亂的嚴重程度呈負相關[23]，但也有研究報道健康人和T2DM患者的 α 多樣性無顯著差異[25-27]。本研究顯示糖調節受損患者在物種多樣性及均勻度上均低于健康人。

經980nm激光治療后，鏈球菌屬相對豐度降低, 副桿菌屬相對豐度升高，研究表明鏈球菌屬可觸發免疫紊亂，加重腸道炎癥反應，而副桿菌屬能夠減少大腸桿菌誘導的腸上皮細胞產生的炎癥因子，增強上皮細胞的完整性，從而發揮抗炎作用[28-29]。α多樣性指數較治療前均有提高，表明腸道菌群的豐富度、多樣性及均勻度均得到改善。有研究表明，波長在600～700nm和780～1100nm的紅色或近紅外區域內的激光可與人體細胞色素c氧化酶產生相互作用，刺激線粒體電子傳遞鏈并增加三磷酸腺苷的產生，影響活性氧的短暫爆發、一氧化氮和鈣離子水平的調節，促進細胞增殖和轉移、增強組織修復和愈合以及新的蛋白質合成[30-31]。既往有學者使用低能激光照射小鼠腹部，結果顯示治療后小鼠的微生物群多樣性發生變化，與健康微生物群相關的細菌的數量明顯增加[32]。對人類個體進行同樣的研究發現，人類腸道微生物群也發生了變化：與健康微生物群相關的粘液阿克曼氏菌、雙歧桿菌屬和桿狀桿菌屬增加，而厚壁與擬桿菌比率降低，推測這一作用可能與光刺激的抗炎和氧化還原信號作用有關[33]。高能激光具有更好的組織穿透性和更大的功率，更具有優勢。我們的研究顯示高能激光輻照后糖調節異常患者的腸道菌群發生改變。

綜上，糖調節異常患者菌群結構存在失衡，多樣性下降，而高能量激光干預能夠在一定程度上改變腸道菌群，提高腸道菌群的多樣性。本研究可為今后繼續探索激光對腸道菌群的干預作用提供思路。可進一步探討不同波長、頻率、能量、治療次數、治療時間等參數下激光對腸道菌群的影響效果，并增加血糖、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數等觀察指標，為激光作為一種新的糾正腸道菌群紊亂、延緩糖調節受損向糖尿病進展的治療手段積累依據。由于腸道菌群影響因素眾多，諸如飲食習慣、作息規律以及患者血糖水平等，加之本次研究的樣本量較少，因此，仍需要更多基于嚴格控制影響因素的大樣本研究來進一步驗證。