幼年特發性關節炎相關性葡萄膜炎患兒外周血CDld(hi)CD5+CD19+調節性B細胞的變化及意義

趙文燕，佘 磊

0引言

幼年特發性關節炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是兒童時期常見的慢性風濕性疾病，外周關節炎為其主要表現，目前有學者認為其發病是由遺傳和環境因素引起的[1]。JIA常伴有淋巴結、皮膚、肝臟等全身多系統受累，而JIA相關性葡萄膜炎(juvenile idiopathic arthritis-associated uveitis，JIA-U)是JIA最嚴重的關節外表現，其在JIA患兒中具有極高的發病風險，通常主要表現為慢性前葡萄膜炎，并且早期無任何眼部不適癥狀，當出現虹膜黏連等癥狀時已嚴重威脅到患兒的視力，所以早期檢測和治療極為必要[2-3]。調節性B細胞(regulatory B cell，Breg)是在機體免疫反應中起負調節作用的一類B細胞，并可通過細胞因子的分泌及細胞表面分子間的相互作用介導免疫反應的負調節，有研究表明其免疫能力主要由其所分泌的白介素10(interleukin 10，IL-10)所介導[4-5]。CD1d(hi)CD5+CD19+Breg是Breg的亞群之一，已被報道在毒性彌漫性甲狀腺腫[6]、原發性干燥綜合征[7]等多種免疫性疾病中具有重要作用[5]。有研究報道稱Breg與JIA的發生密切相關，但其是否參與JIA-U的發生還未見報道[8]。因此本研究通過檢測JIA-U患兒外周血中CDld(hi)CD5+CD19+Breg水平，探究其在JIA-U中的變化及意義，以期為JIA-U的早期檢測和判斷疾病嚴重程度提供數據支持。

1對象和方法

1.1對象選取2018-04/2020-05本院確診收治的JIA-U患兒95例作為JIA-U組，其中活動期43例，靜止期52例。70例JIA患兒作為JIA組，其中活動期33例，靜止期37例。另選同時期正常健康體檢兒童75例作為對照組。根據JIA-U疾病嚴重程度評分：房水細胞或房閃陽性、睫狀充血、虹膜黏連、角膜后沉著物、玻璃體有細胞或者視網膜病變各1分[9]。JIA-U及JIA納入標準：符合青少年JIA國際風濕病協會聯盟(ILAR)分類標準[10]，JIA-U在此基礎上接受常規眼科篩查評估確診；臨床資料完整；患兒未接受糖皮質激素等藥物手段治療；患兒均未患其它全身性免疫系統疾病。排除標準：患兒患有先天性心臟病、有過敏傾向等其他疾病。對照組納入標準：既往身體健康且健康體檢結果正常；排除標準：近期服用糖皮質激素或抗生素。所有受試者均通過本院醫學倫理委員會批準，所有受試者及其家屬知情同意并簽署同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器IL-10 ELISA檢測試劑盒(貨號：CK-E10155)購自武漢益普生物科技有限公司；藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標記的鼠抗人CD1d抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的鼠抗人CD5抗體、多甲藻素葉綠素蛋白(peridininchlorophyll- protein，PerCP)標記的鼠抗人CD19抗體、IgG1-PerCP-cyTM(貨號：550255、555352、561295、550795)購自BD Biosciences；鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE(貨號：sc-2855、sc-2866)購自Santa Cruz Biotechnology；RPMI Medium 1640、胎牛血清(貨號：BL1098、ZCNXQ03-KIL)購自北京百奧萊博科技有限公司。Thermo賽默飛世爾Multiskan FC酶標儀購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.2樣品采集及CD1d(hi)CD5+CD19+Breg檢測患兒于就診當日抽取靜脈血4mL，健康體檢兒童抽取等量靜脈血，肝素鈉抗凝一部分離心取血漿，一部分密度梯度離心法分離單個核細胞，5min，1500r/min離心棄上清，PBS兩次洗滌后再次用PBS重懸細胞調整濃度為1×106/mL，吸取100μL，加入CD1d-PE、CD5-FITC、CD19-PerCP各10μL混勻，而每個樣本的同型對照加入IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP-cyTM各10μL，30min室溫避光孵育后加入紅細胞裂解液混勻靜置15min，于流式細胞儀檢測并用Cell Quest軟件進行分析。

1.2.3ELISA檢測IL-10水平取1.2.2中血漿標本根據IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書處理樣本，在450nm處檢測OD值，計算血漿IL-10水平。

2結果

2.1一般資料三組受試者年齡、性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，與JIA組相比，JIA-U組JIA病程、JIA亞型差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組一般資料比較

2.2各組外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例變化對照組、JIA組、JIA-U組患兒外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例分別為(2.64±0.72)%、(1.96±0.35)%、(1.31±0.20)%，差異有統計學意義(F=174.176，P<0.01)；與對照組相比，JIA組、JIA-U組患兒外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與JIA組相比，JIA-U組CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。與靜止期相比，活動期JIA及JIA-U患者CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 活動期與靜止期JIA及JIA-U患者外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例比較

圖1 流式細胞儀檢測各組外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例結果 A：CD19設門圖；B：對照組；C：JIA組；D：JIA-U組。

2.3各組IL-10的表達情況對照組、JIA組、JIA-U組患兒血漿中IL-10水平分別為20.33±5.16、31.22±4.79、43.35±6.74pg/mL，差異有統計學意義(F=339.327，P<0.01)；與對照組相比，JIA組、JIA-U組患兒血漿中IL-10水平顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.01)；與JIA相比，JIA-U組IL-10水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與靜止期相比，活動期JIA及JIA-U患者IL-10水平顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 活動期與靜止期JIA及JIA-U患者外周血IL-10的表達比較

2.4JIA-U患兒CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10的相關性JIA-U患兒CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10呈負相關(r=-0.377，P<0.01)，見圖2。

圖2 JIA-U患兒CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10表達的相關性。

2.5CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與JIA-U患者病情嚴重程度評分的相關性CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與JIA-U患者病情嚴重程度呈顯著負相關(r=-0.225，P=0.028)，見圖3。

圖3 CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與JIA-U患者病情嚴重程度的相關性。

2.6Logistic回歸分析影響因素JIA-U發生的因素選取上述檢測指標中存在顯著性差異的指標作為自變量，對CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例、JIA亞型、關節炎病程、IL-10水平進行Logistic回歸分析發現，四者均對JIA-U發生存在影響(P<0.05)。多因素分析發現，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg低比例、JIA少關節型、關節炎病程<4a、IL-10高水平均是影響JIA-U發生的危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 Logistic回歸分析影響JIA-U發生的因素

3討論

JIA具有與慢性炎癥性關節炎相同的癥狀，而葡萄膜炎是JIA的最常見的關節外表現，是一種常見的眼部炎癥性疾病，其特征是虹膜、脈絡膜、視網膜等部位出現炎癥癥狀，解剖學將其分為前葡萄膜炎、中葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎，并且在慢性前葡萄膜炎發作時可能無癥狀表現，若不能得到及時有效的治療，可導致患兒失明[2，11-13]。因此JIA-U的早期檢測和治療對患者的健康十分重要。

B細胞在自身免疫疾病的發生機制中具有重要作用，可通過產生抗體或呈遞抗原促進T細胞活化，除此之外，還可通過促進炎癥因子的分泌或抑制T細胞增殖來調節免疫功能[14]。Breg是一類僅可以通過分泌IL-10發揮其免疫抑制功能的B細胞，CDld(hi)CD5+CD19+是Breg的其中一個表型，研究表明其數量、功能的異常是自身免疫疾病發生的重要機制[15-16]。有研究學者將能夠分泌IL-10的CDld(hi)CD5+B細胞亞群稱為B10細胞[16]。許多研究發現，Breg在類風濕性關節炎[16]、JIA[17]等關節炎疾病中具有重要作用，并參與其發生發展。如產生IL-35的B細胞(i35-Bregs)可治療葡萄膜炎等自身免疫或傳染性疾病[18]。CD19+CD24hiCD38hiBreg在JIA患兒外周血中比例與健康對照組相比顯著降低[17]。IL-10是一種免疫抑制因子，可通過抑制促炎因子的產生及T細胞活化達到抑制炎癥反應的作用[19]。研究發現，在JIA患兒中IL-10水平在統計學中顯著增加，這與IL-10的基因多態性有關，如：IL-10-1082 AA基因變體與多關節青少年特發性關節炎(pJIA)的易感性之間存在顯著正相關性[20]。有學者發現自身免疫性葡萄膜炎模型大鼠血清中IL-10含量顯著高于對照組，二者的含量升高可能是機體自然恢復機制的作用[19]。JIA-U患兒血清中IL-10水平高于JIA患者，其水平升高是眼部炎癥的危險因素[21]。本研究發現與對照組相比，JIA組、JIA-U組患兒外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例依次顯著降低，而IL-10水平依次顯著增加，與前人研究結果相一致，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例與IL-10表達及JIA-U患者病情嚴重程度呈顯著負相關關系，該結果表明CD1d(hi)CD5+CD19+Breg參與JIA-U的發生發展，IL-10水平的升高可能是由T淋巴細胞等其他免疫細胞所分泌，該機制與機體自身免疫功能的恢復有關。而本研究進一步探究結果發現，與靜止期相比，活動期JIA及JIA-U患者CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例顯著降低，IL-10水平顯著增加，該結果表明，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例隨著疾病活躍程度增大而降低，而IL-10水平隨疾病活躍程度增大而增多。

研究顯示，發病年齡≤6歲、關節炎病程<4a、少關節型是造成JIA-U發生的危險因素[22]。而本研究多因素分析發現，除了關節炎病程、關節亞型是影響JIA-U發生的危險因素外，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg低比例、IL-10高水平也是影響JIA-U發生的危險因素，與前人研究結果部分一致。這表明，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的數量異常可能與JIA-U的發生有關，該結果為JIA-U的早期檢查提供了一個潛在的監測指標，而發病年齡未納入危險因素這點與前人研究存在差異可能是因為納入病例數量欠缺所造成的。

綜上所述，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg在JIA-U患兒外周血中比例顯著降低，其可能參與JIA-U的發生發展，有作為JIA-U疾病早期監測及嚴重程度判斷檢測指標的潛能。本研究不僅為JIA-U的早期檢測和判斷疾病嚴重程度提供了有價值的數據支持，還為其靶向治療研究提供了參考。但由于病例樣本量的局限，研究可能出現一些統計缺陷，因此，在未來的研究中會進一步擴大樣本量。