外周血T淋巴細胞及雙陰性T細胞在乳腺癌中的變化及臨床意義

左永剛 劉家才 郭鑫 溫玉清 夏書官 馬明德(河南大學淮河醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,河南 開封 475000)

全球2020 數(shù)據(jù)庫顯示,乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升,已超過肺癌成為世界上最常見的惡性腫瘤,也是女性死亡的主要原因〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn),免疫細胞從正常乳腺組織開始進行免疫監(jiān)測,一直到原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌,其在整個乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中起關(guān)鍵作用〔3〕。近些年來,人們對免疫治療領(lǐng)域的興趣日益增加,也促進了對乳腺癌免疫微環(huán)境的深入研究,使得很多免疫細胞已成為臨床相關(guān)性和高度重復性的生物標志物。本研究利用流式細胞技術(shù)檢測乳腺癌患者及乳腺良性腫瘤患者外周血CD3+、CD4+、CD8+及雙陰性T(DNT)細胞,探討免疫細胞分布情況及臨床價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 納入2021年12月至2022年6月在河南大學淮河醫(yī)院首診住院治療的女性乳腺癌(病理類型為浸潤性非特殊癌)患者132 例為病例組,收集入院治療前外周血T 淋巴細胞亞群及DNT細胞數(shù)值及比例,年齡、腫瘤大小、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子(HER)-2、Ki-67、分子分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期、組織學分級等;收集同時期醫(yī)院100 例女性乳腺良性腫瘤患者為對照組。兩組年齡、身高、體重、體重指數(shù)(BMI)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表1。

表1 兩組基本情況對比(±s)

表1 兩組基本情況對比(±s)

組別 n年齡(歲)身高(cm)體重(kg) BMI(kg/m2)132 49.9±10.5 159.1±5.0 62.1±10.524.5±3.8對照組100 47.6±11.4 160.1±5.661.5±9.824.0±3.7 t 值P 值病例組-1.57 0.118-1.45 0.147 0.44 0.605 1.03 0.304

1.2 儀器與試劑 流式細胞儀BD FACSCanto、DT5-3 型低速臺式自動平衡離心機、微量移液器、CD3-FITC 熒光單克隆抗體試劑、CD4-PC7 熒光單克隆抗體試劑、CD8-APC-Cy7 熒光單克隆抗體試劑、10 倍溶血素。

1.3 實驗方法 所有患者晨起及空腹條件下靜脈穿刺外周全血樣本2～5 ml,采用乙二胺四乙酸(EDTA)-K2 抗凝后室溫存放,樣本要求室溫且避免震蕩,血液采集后24 h 內(nèi)使用。流式細胞術(shù)步驟:①在流式管底部加入20 μl CD3、CD4、CD8 試劑;②采用反向移液技術(shù)吸取50 μl 混勻的EDTA-K2 抗凝全血,加入管底,避免血液碰到管壁上部;③蓋上管帽,輕輕渦動混勻約3 s,室溫避光反應(yīng)15～25 min;④向管內(nèi)加入450 μl 血細胞分析用溶血劑;⑤蓋上管帽,輕輕渦動約10 s,室溫避光孵育15 min;⑥加入絕對計數(shù)微球后,上機檢測。檢測結(jié)果通過流式細胞儀分析軟件自動分析獲得。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 軟件進行t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗、Kruskal-WallisH檢驗,采用受試者工作特征(ROC)曲線探究診斷價值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血T 淋巴細胞亞群及DNT 細胞比較病例組CD3+T 細胞、CD4+T 細胞、DNT 細胞絕對值低于對照組,而CD8+T 細胞絕對值高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05),見表2。

表2 兩組外周血T 細胞亞群及DNT 細胞比較〔M(P25,P75),絕對值/μl〕

2.2 外周血T 細胞及DNT 細胞預測乳腺腫瘤良惡性的診斷 根據(jù)ROC 曲線顯示,CD3+T 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞及DNT 細胞絕對值預測乳腺腫瘤良惡性的曲線下面積(AUC)均＞0.5,見表3。對于預測乳腺腫瘤良惡性均具有很好的價值,見圖1。

圖1 外周血T 細胞及DNT 細胞預測乳腺腫瘤良惡性ROC 曲線

表3 外周血T 細胞及DNT 細胞的ROC 曲線

2.3 乳腺癌患者外周血T 細胞及DNT 細胞與臨床特征的相關(guān)分析 132 例乳腺癌患者樣本中,隨著腫瘤增大,CD3+T 細胞、DNT 細胞絕對值表達顯著降低(P＜0.05);CD4+T 細胞、CD8+T 細胞絕對表達差異不顯著(P ＞0.05),但其表達有增加趨勢。CD3+T 細胞絕對值在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達顯著低于未轉(zhuǎn)移組(P＜0.05);CD3+T 細胞、DNT 細胞絕對值在TNM 不同分期表達顯著差異(P＜0.05),見表4。

表4 外周血T 細胞及DNT 細胞絕對值與臨床特征相關(guān)分析〔M(P25,P75,μl〕

2.4 乳腺癌患者外周血T 細胞及DNT 細胞與分子分型的相關(guān)分析 132 例乳腺癌患者LuminalA 型46 例(34.8%),LuminalB 型30 例(22.7%),HER-2陽性型28 例(激素受體陽性10 例)(21.2%),三陰性28 例(21.2%)。CD3+T 絕對值在ER、PR 陽性組的表達顯著高于陰性組(P＜0.05);CD4+T 細胞絕對值在HER-2 陽性組的表達低于陰性組,CD8+T 細胞絕對值在HER-2 陽性組的表達顯著高于陰性組(P＜0.05);CD4+T 細胞、CD8+T 細胞絕對值在不同分子分型組的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表5。

表5 外周血T 細胞及DNT 細胞絕對值與分子分型的相關(guān)分析〔M(P25,P75),μl〕

3 討 論

正常人體內(nèi)免疫系統(tǒng)中的免疫細胞處于一個動態(tài)平衡狀態(tài),當存在免疫抑制和免疫缺陷或嚴重復合型免疫缺乏癥時,其患癌的風險顯著增加,揭示了免疫反應(yīng)在癌癥中的重要性〔4〕。外周血T 淋巴細胞亞群作為免疫細胞中的重要組成,不僅參與細胞機體的免疫調(diào)節(jié),還參與機體的免疫應(yīng)答反應(yīng),其細胞組成的數(shù)量更是反映了免疫現(xiàn)狀〔5〕。T 淋巴細胞作為機體發(fā)揮免疫作用的重要細胞成分,其表面抗原包括共受體CD3+T、CD4+T(輔助性T 細胞)、CD8+T(細胞毒性T 細胞或殺傷性T 細胞)〔6〕。其中CD3+T 細胞是T 淋巴細胞的典型表面抗原,可反映出T 淋巴細胞的絕對數(shù)值,也可綜合反映出機體現(xiàn)有的免疫狀態(tài)水平。在機體遭受創(chuàng)傷、感染、自身免疫功能衰竭及腫瘤的發(fā)生發(fā)展時,CD3+T 細胞的絕對數(shù)值出現(xiàn)異常〔7〕。在乳腺癌患者中,有報道在新輔助化療后、放療后、手術(shù)后CD3+T 細胞數(shù)值出現(xiàn)一定程度減少,可能提示患者的免疫功能下降,相反更高濃度浸潤淋巴細胞與更好的預后或與化療反應(yīng)相關(guān)〔8,9〕。CD8+T 細胞被認為是抗腫瘤的關(guān)鍵組成部分,具有較高水平的CD8+T 細胞的乳腺腫瘤與其有更好的生存期相關(guān)〔10,11〕。CD4+T 淋巴細胞作為免疫系統(tǒng)中的中心成員,在招募、激活和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的許多方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,其輔助功能為B 細胞和CD8+細胞毒性T 細胞介導的反應(yīng)提供了充分證據(jù)。Gu-trantien 等〔12〕研究中,CD4+T 細胞在乳腺癌中不僅是一個至關(guān)重要的免疫元件,更是影響乳腺癌患者預后的一個重要因素。有研究顯示,如體內(nèi)缺乏足夠的CD4+T 細胞,CD8+T 細胞將無法有效發(fā)揮其免疫作用。CD4+T 細胞還通過形成炎癥反應(yīng)特征來不同程度的影響先天免疫。目前研究發(fā)現(xiàn)CD4+T 淋巴細胞通過自身細胞毒性溶解人體內(nèi)病原體的靶細胞,其抗腫瘤作用也可結(jié)合MHCⅡ類分子,通過顆粒酶調(diào)節(jié)或穿孔素的殺傷作用來溶解腫瘤細胞〔13〕。

本研究顯示,與乳腺良性腫瘤相比較,CD3+T 細胞、CD4+T 細胞水平均明顯減少;CD8+T 細胞的絕對值水平明顯升高;CD3+T 細胞及CD4+T 細胞絕對值明顯減少直接反映了乳腺癌患者免疫功能低下,與相關(guān)文獻報道結(jié)果相一致〔14,15〕。分析其原因,CD4+T 細胞及CD8+T 細胞作為外周血淋巴細胞的主要亞型處于動態(tài)平衡狀態(tài),CD4+T 淋巴細胞分泌顆粒酶、穿孔素等細胞因子和激活CD8+T 淋巴細胞通過Fas/Fasl 等方式途徑發(fā)揮細胞毒素作用〔16〕。當機體腫瘤發(fā)生時,其分泌某些大量免疫抑制因子,導致機體的免疫功能及平衡遭到破壞,誘發(fā)CD8+T細胞的產(chǎn)生,并反饋性抑制CD4+T 細胞的成熟及產(chǎn)生,從而產(chǎn)生乳腺癌患者外周血中CD4+T 細胞數(shù)量的減少及CD8+T 細胞絕對數(shù)值的增加,打破了T 淋巴細胞亞群的動態(tài)平衡,進而機體的免疫功能紊亂,導致腫瘤進一步發(fā)生及發(fā)展〔17〕。

目前,判斷乳腺癌患者的嚴重程度及預后的影響因素包括腫瘤大小、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學分級、病理指標等。腫瘤大小是乳腺癌患者預后的重要指標之一,Zwittex〔18〕在針對T 細胞的研究中指出腫瘤本身在不斷發(fā)生發(fā)展的過程中能產(chǎn)生大量免疫抑制因子抑制T 淋巴細胞產(chǎn)生及成熟,隨著腫瘤的逐漸生長,其負荷也不斷增大。是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直接關(guān)系到患者治療方案及預后,To等〔19〕研究顯示伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌惡性程度更高,其生存期遠低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,提示腫瘤的免疫逃逸及免疫抑制更為嚴重。同時隨著臨床分期的增加,乳腺癌患者機體的免疫功能損傷也更加嚴重〔20〕。本研究結(jié)果表明隨著腫瘤增大,CD3+T細胞絕對值明顯降低,CD3+T 細胞絕對值在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達明顯低于未轉(zhuǎn)移組,CD3+T 細胞絕對值隨著分期的增加而降低,與郝華等〔21〕研究結(jié)果相符,提出隨著腫瘤增大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的增加,免疫功能明顯受到抑制。本研究CD3+T 細胞呈明顯下降趨勢,同樣提示機體的免疫功能遭到嚴重的抑制及損傷。

乳腺癌是一種與機體激素分泌密切相關(guān)的腫瘤,尤其是雌激素與孕激素對乳腺癌患者發(fā)生、發(fā)展、治療方案的選擇及預后的影響極為重要。本研究表明,CD3+T 絕對值在ER、PR 陽性組的表達均高于陰性組,與相關(guān)研究結(jié)果相符〔22〕。CD3+T 細胞作為總的外周T 淋巴細胞,對于反映機體抗腫瘤免疫能力也尤為重要,研究也表明非激素受體敏感型的乳腺癌相比較激素受體敏感型的免疫力更加低下,與臨床上相比較激素受體陽性的乳腺癌患者,激素受體陰性的乳腺癌患者侵襲能力更強、發(fā)展更快、預后較差的結(jié)果相吻合。

作為原癌基因,HER-2 是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體蛋白,其過表達可促使癌細胞增殖、腫瘤血管及淋巴管產(chǎn)生、增加其侵襲能力及抑制癌細胞凋亡等,使得癌細胞發(fā)展迅速,風險相對較高,總生存率較差。韋常宏〔23〕研究發(fā)現(xiàn)HER-2 過表達的乳腺癌患者循環(huán)血中CD4+T 細胞明顯降低,表現(xiàn)出較強侵襲力和較快的發(fā)展速度。Muraro 等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)HER-2 陽性循環(huán)CD8+T 細胞數(shù)量相對更多,結(jié)論證實乳腺癌患者表現(xiàn)出有限的腫瘤相關(guān)免疫抑制。Jia 等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中高數(shù)量CD8+T 細胞的乳腺癌患者HER-2 陽性可能性大。本研究結(jié)果說明HER-2 陽性的乳腺癌患者機體免疫功能遭到破壞程度更大,免疫能力也更低下。

Ki-67 是由Gerdes 等〔26〕發(fā)現(xiàn)的可作為一種細胞增殖標志物的核蛋白,此核蛋白與乳腺腫瘤的增殖能力息息相關(guān),其表達水平越高,腫瘤的增殖能力越強,發(fā)展速度越快。但研究中Ki-67 值與外周血T淋巴細胞無顯著相關(guān),其原因可能與納入研究組例數(shù)或病人選擇存在偏倚有關(guān),待以后進一步驗證。

目前研究普遍表明,分子分型是乳腺癌患者預后的危險因素,與乳腺癌患者的治療及預后密切相關(guān)〔27〕。一般認為,LuminalA、LuminalB 型乳腺癌發(fā)展速度慢、侵襲力差、預后相對較好,三陰型乳腺癌則相反。在Gao 等〔28〕的系統(tǒng)評價中,通過收集近些年大量數(shù)據(jù),推斷CD4+T 細胞及CD8+T 細胞絕對值可以預測三陰型乳腺癌預后,且其水平越低,預后越差,與相關(guān)研究結(jié)果相一致〔23〕,提示三陰型乳腺癌有相對較強的侵襲力、發(fā)展速度快且預后較差。本研究結(jié)果提示,外周血CD4+T 及CD8+T 淋巴細胞絕對值與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)。

DNT 細胞(CD3+CD4-CD8-T 細胞)是來源仍未明確的免疫細胞,可作為免疫系統(tǒng)對腫瘤激活狀態(tài)的潛在替代品,且能夠反映耐受性和細胞毒性活性的程度,在免疫系統(tǒng)疾病、排斥反應(yīng)及腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),DNT 細胞在免疫系統(tǒng)疾病或腫瘤疾病中的數(shù)量和功能的下降可能導致效應(yīng)CD4+T 細胞和細胞毒性CD8+T 細胞的免疫調(diào)節(jié)喪失,從而破壞機體免疫,導致疾病進一步發(fā)展〔29〕。在一些前瞻性研究中,通過裸鼠腫瘤模型均證明DNT 細胞具有殺傷腫瘤的作用:(1)DNT 通過Fas/FasL 通路參與了的抗腫瘤機制〔30〕;(2)DNT 細胞通過分泌細胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用〔31〕;(3)DNT 細胞通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)發(fā)揮抗腫瘤作用〔32〕。根據(jù)近年來針對DNT 細胞在人體多種腫瘤中的報道表明,DNT 細胞在肺癌、胰腺癌及白血病患者的異種移植模型中具有顯著抗癌活性〔33～36〕,且發(fā)現(xiàn)輸注異種DNT 細胞也不會誘導移植物抗宿主病。針對這一獨特特性,支持其作為一種新型抗癌的免疫治療方法的潛力。Fang 等〔37〕研究通過建立晚期肺癌異種移植模型,發(fā)現(xiàn)體外擴增患者及健康供體來源的DNT 細胞顯著抑制晚期肺癌異種移植物的生長。Lu 等〔38〕研究中通過分離外周DNT 細胞與胰腺癌Panc-1 共培養(yǎng),結(jié)果表明DNT 細胞抑制人胰腺癌細胞的侵襲和增值。這些研究均體現(xiàn)了DNT 細胞在抗腫瘤免疫治療的潛在價值。本研究結(jié)果提示乳腺癌惡性程度越高,DNT細胞的頻率越低,與Strippoli 等〔39〕在尋求黑色素瘤的腫瘤標志物及治療靶點的研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致,DNT 細胞的減少與機體整體反應(yīng)顯著相關(guān)。這可能是DNT 細胞與腫瘤相互作用產(chǎn)生的結(jié)果,但具體作用機制仍需進一步研究。

目前傳統(tǒng)的乳腺癌血清腫瘤標志物有TAP、CEA 及CA15-3,臨床上用于篩查和診斷乳腺癌的特異度及敏感度并不是特別理想,本研究明確了CD3+T、CD4+T、CD8+T、DNT 細胞絕對值及DNT 細胞比例在乳腺癌及良性腫瘤患者中存在差異,說明對于乳腺良惡疾病診斷上具有一定價值。本研究結(jié)果顯示,CD3+T 細胞相比較其他外周血T 細胞亞群的AUC 值最大,提示在預測乳腺腫瘤良惡性診斷價值相對較高。DNT 細胞絕對值及DNT 細胞比例的敏感度較高,CD8+T 細胞特異性較高,對于早期診斷乳腺腫瘤良惡性也具有一定輔助價值。雖結(jié)果相比傳統(tǒng)血清腫瘤標志物仍較低,但可以加入傳統(tǒng)的組合檢測模型進一步提高乳腺癌的早期診斷價值,作為一個臨床早期診斷惡性腫瘤的有益補充。

綜上,外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T 及DNT 細胞對于診斷乳腺腫瘤良惡性有參考價值,且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及分子分型有相關(guān)性,可輔助臨床上乳腺癌早期篩查、診斷及病情分析。