ET-1作為癌前病變分子標志物的價值及應用

孟韜 張大偉 ( 吉林省人民醫院結直腸肛門外科,吉林 長春 3000; 長春市人民醫院普通外科)

直腸癌系源于上皮的腫瘤,其中腺癌占95%,也是最常見的消化道腫瘤,在大城市發病率明顯上升。經深入研究,約70%是由腺瘤性息肉演變而來。隨分子生物學技術的發展,癌變過程中的基因改變逐漸被認識,已知直腸癌的發生、發展是一個多步驟、多階段、多基因參與的細胞遺傳性疾病;因此尋找一種特異的分子標志物對直腸癌的早期診斷十分重要。隨分子生物學檢測技術的提高,對直腸癌生物學特性的不斷深入,內皮素(ET)及其拮抗劑成為近年來研究的熱點。ET 在諸多惡性腫瘤中呈現出不同的表達狀態,并參與腫瘤的進展、轉移、血管重構等〔1〕,其中以ET-1 的表達最為突出〔2〕,多項研究〔3～5〕先后報道了ET-1 在乳腺癌組織及血液中呈高表達狀態,可作為腫瘤標志物檢測,然而在直腸癌中表達情況國內報道甚少。本研究擬分析ET-1 作為癌前病會分子標志物的價值及應用。

1 材料與方法

1.1 標本收集與分組 前瞻性收集吉林省人民醫院肛腸外科直腸癌患者60 例(直腸癌組);其中女23 例,男37 例;年齡58～88 歲,中位年齡73 歲;直腸癌病理類型:腺癌30 例、黏液腺癌15 例、腺鱗癌10 例、其他特殊型癌5 例。取癌旁正常良性組織標本30 例為良性組,癌前病變組織標本30 例(腺瘤)為癌前病變組。入選前均經腸鏡檢查,明確病理學診斷。另選健康志愿者血清標本20 例為血清對照。入組標準:①術前均行腸鏡檢查并取病理活檢,明確病理診斷為直腸癌、良性腺瘤;②未接受過放、化療、靶向等抗腫瘤藥物治療;③預期生存期≥3 個月;④輔助檢查評估心、肝、腎等主要臟器功能基本正常。排除標準:①接受過放化療治療、靶向治療;②合并骨轉移、嚴重骨質疏松;③存在嚴重或不能控制的全身性疾病者;④無法控制的活動性感染、各類傳染病者。所有患者自愿入組,符合醫學倫理標準。將3 組病理組織適量分別放入30%甲醛浸液中保存待測。

1.2 直腸癌組織ET-1 檢測 采用免疫組化法(IHC)測定,標本用ABC 法標記:①制作石蠟切片;②脫蠟;③去除內源酶3%H2O215 min;④蒸餾水與0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4) 浸洗;⑤一抗:兔抗大鼠ET-1 抗血清(上海德波生物技術有限公司)1 ∶400,4℃過夜孵育;⑥PBS 浸洗;⑦二抗:生物素化羊抗兔抗血清1 ∶500,37℃30 min;⑧PBS浸洗;⑨三抗:ABC 復合物,1 ∶100,37℃40 min;○10二氨基聯苯胺(DAB)顯色,5 min。每例切片選5 個高倍視野(×400),隨即選測80～100 個ET-1 細胞吸光度值,計算平均吸光度值,以平均值(A)表示細胞中的ET-1 的含量。

1.3 血清ET-1 檢測 清晨空腹采集右肘部靜脈血3～5 ml,手術患者術前1～3 d 采集。采集完成后注入含10%乙二胺四乙酸二鈉和抑肽酶的試管中混勻(上海艾研生物、貨號367863、6 ml),4℃下,3 000 r/min離心15～20 min。分離出血清用0.1%TFA 6 ml 酸化,3 000 r/min離心20 min 后取其上清液,放置于-80℃冰箱保存待測。術后7～10 d 再次采集血液標本,制作及保存方法同上。

1.4 結果判定 IHC:應用德國CMIAS-008 型真彩色醫學圖像分析儀,IHC 標記顯示:ET-1 陽性細胞其胞質表現為棕黃色或黃色細顆粒狀,若陽性細胞在標記的細胞總數中超過60%者,標記為陽性病例。PCR:試劑盒為進口Austria 生產,儀器:γ 計數儀為美國bookman。主要技術參數:ET-1 測定范圍20～4 680 pg/ml,靈敏度10 pg/ml,回收率平均95%～100%,批內變異系數(CV)＜5%,批間CV＜10%,正常參考值38.78～71.50 pg/ml。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1 IHC 測定3 組ET-1 吸光度值比較 直腸癌組平均吸光度值(0.233±0.071)＞癌前病變組(0.107±0.060)＞良性組(0.029±0.072),差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 術前、術后3 組血清ET-1 水平比較 術前直腸癌組血清ET-1 表達水平〔(77.87±7.98)pg/ml〕明顯高于癌前病變組〔(51.21±8.43)pg/ml〕和良性組〔(42.28±8.34)pg/ml;P＜0.01〕,術后〔(72.25±8.56)pg/ml〕較術前明顯降低(P＜0.01),但仍顯著高于良性組和癌前病變組(P＜0.01)。

2.3 直腸癌組織與臨床病理分級、淋巴結、TNM 分期的關系 直腸癌組血清ET-1 與組織ET-1 表達結果吻合,組織學分級越差表達越高、伴淋巴結轉移陽性者表達越高、TNM 分期越高表達越高(均P＜0.05)。見表1。

表1 組織ET-1、血清ET-1 與直腸癌臨床特征關系(±s)

表1 組織ET-1、血清ET-1 與直腸癌臨床特征關系(±s)

臨床病理n組織ET-1t 或F 值P 值血清ET-1t 或F 值P值組織學分級 高分化100.171±0.0612.923＜0.0573.42±08.235.668＜0.05中分化280.209±0.09176.37±08.24低分化220.293±0.05279.45±09.73淋巴結轉移 陽性360.305±0.03818.694＜0.0581.82±08.714.346＜0.05陰性240.125±0.03469.77±09.12 TNM 分期 Ⅰ～Ⅱ期260.191±0.09214.381＜0.0574.76±08.563.062＜0.05Ⅲ期220.225±0.08576.47±08.52Ⅳ期120.338±0.08882.82±08.62

3 討 論

ET 是1988年由Yanagisawa 等〔6〕首次從培養的豬主動脈內皮細胞上清液中分離并純化出來,由21種氨基酸殘基組成的一種血管活性多肽,具有多種生物學作用〔7〕,如收縮血管、導致疼痛、促進腫瘤浸潤與轉移。在正常人血液中ET 主要由血管內皮細胞產生,起到一種神經調節因子或局部激素樣作用,ET-1 有兩個同分異構體〔8〕:ET-1、ET-2。其中ET-1起決定性生理作用〔2〕,腫瘤細胞表達趨化因子受體CCR7 可被ET-1 與受體ETA 結合作用及同HIF-let協調共同促進,其表達的趨化因子受體可以通過其趨化性誘導入侵和轉移及肌動蛋白聚合和偽足的形成,如通過淋巴轉移,顯示腫瘤的器官特異性轉移〔9,10〕。近年來研究表明ET-1 大量存在于惡性腫瘤細胞內,與腫瘤生長、浸潤關系密切〔11〕。而國內對ET-1 在直腸癌組織內報道甚少。

本研究結果說明直腸癌組織細胞內大量存在ET-1,多項研究提出在乳腺癌患者組織及血清中含有大量ET〔3～5〕,并可作為乳腺腫瘤標志物檢測,與胃癌組織內表達相同。本文結果還說明,ET-1 在直腸癌患者腫瘤組織中及血液中大量存在,癌前病變內也廣泛存在,因此聯合ET-1 檢測對直腸癌的篩查及協助直腸癌診斷同樣具有一定參考價值,并可以單獨作為直腸癌腫瘤的分子標志物,其血清學檢測方法快捷、便利、且無創。

本研究結果表明,直腸癌惡性程度越高,ET-1表達水平及平均吸光度值越高,其中在低分化直腸癌中ET-1 表達最高,如合并淋巴結轉移者表達會更加明顯,分期越高表達越高。這可能因為惡性程度高的直腸癌細胞,其增殖、浸潤能力較強,所以其在腫瘤增殖及浸潤中扮演重要角色,與相關研究內容一致〔12,13〕。這對判斷直腸癌患者臨床分期、惡性程度和預后有重要意義。另外本文進一步說明ET-1表達情況和直腸癌轉移具有相互一致性,并可以作為判斷預后的一項因素。故臨床應用中可以通過檢測ET-1 初步評價患者病理、臨床分期,甚至可以判斷遠期預后。本研究還存在不足之處:(1)目前標本收集數量有限,需要大量數據支持;(2)病理類型較多未進行細化;(3)癌前病變標本單一,本研究只有腺瘤,需要更多癌前病變標本加以支持;(4)血清ET-1 對判斷遠期預后還需要進一步隨訪。目前還有學者研究ET 能促使癌細胞血管、淋巴管生成〔14,15〕,雖然ET 在不同組織的具體作用還存在一定爭議,但ET-1 在上述腫瘤中表達明顯,因此利用ET 受體拮抗劑行分子靶向治療將成為治療胃癌的新希望,有待于更多臨床數據證實。