復方甘草酸苷對帶狀皰疹后遺痛大鼠脊髓背角PINK1/Parkin相關神經細胞自噬的影響

田佳玉 馮丹 張書力 胡焓 李少軍 (武漢市第一醫院疼痛科,湖北 武漢 430000)

帶狀皰疹后遺痛(PHN)是指帶狀皰疹消退后遺留的頑固性神經病理性疼痛,常表現為持續性、陣發性刺痛、刀割痛、跳痛、灼痛等,該病治療難度大,病程時間長且易反復,嚴重影響患者生活質量〔1～3〕。脊髓背角是痛覺傳導的重要部位之一,具有加工、處理、整合痛信息等作用,資料顯示PHN 的產生、發展與病毒感染后的組織損傷及炎癥引起的脊髓背角損害密切相關〔4〕,張愛民等〔5〕研究表明PHN 病情的維持機制可能與脊髓相關神經過度自噬有關,因此探究具有調節相關神經細胞自噬活性的藥物對于治療PHN 具有重要的意義。復方甘草酸苷具有抗炎、抗病毒、免疫調節等多種生物活性,虞紅等〔6〕研究表明在PHN 治療早期加服復方甘草酸苷片可明顯縮短患者的疼痛痊愈時間,并減少PHN 不良反應的發生,因此推測復方甘草酸苷可能與調節機體炎癥因子表達及神經細胞自噬有關,但其作用機制仍不清晰。PINK1/Parkin 信號通路是目前已知的介導細胞線粒體自噬的重要途徑,Parkin 是細胞清除受損線粒體的關鍵蛋白,可能與PHN 脊髓背角相關神經元退行性病變有一定的關聯〔7,8〕。本研究探討復方甘草酸苷對PHN 大鼠脊髓背角PINK1/Parkin 信號通路及相關神經細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF 級SD 雄性大鼠(北京生命科學研究所動物實驗中心),約3月齡,體重(175～220 g),生產許可證號:SYXK(京)2015-0002。所有實驗大鼠于本院動物房中飼養,相對濕度55%,溫度25℃,自然光照,自由進食、進水,每周清潔一次鼠籠、保持動物房環境通風、整潔、每天更新食物及飲用水,適應性喂養1 w。本研究經動物倫理委員會批準同意。

1.2 主要試劑及儀器 復方甘草酸苷(貨號:H20073723)購于樂普藥業股份有限公司;樹脂毒素(RTX,貨號:57444-62-9)購于北京寰宇科技;大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、干擾素(IFN)-γ ELISA 試劑盒、兔源LC3、Beclin-1、p62、PINK1、Parkin 一抗、β-actin、羊抗兔二抗(貨號ab208348、ab197742、ab239425、ab192890、ab256743、ab109012、ab216144、ab77924、ab8226、ab150077)購于美國Abcam 公司;蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號P0027、P0011)購于上海碧云天公司等。

爪觸覺測試儀、電子觸覺測量儀、足底熱刺激儀(型號:37450、38450、37370)購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司;全自動生化分析儀(型號PUZS-300)購于上海帝博思生物科技有限公司;手動輪轉式切片機(型號RM2125RTS)購于德國Leica 公司;光學顯微鏡(型號SMZ745)購于日本尼康公司;透射電鏡(型號:LVEM5)購于美國Quantum Design;酶標儀(型號XElx800)購于美國Perkin Elmer 公司;蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD)購于美國Bio-Rad 公司;凝膠成像儀(型號:GIS-500)購于Miulab 公司等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥 參考文獻〔9〕制備PHN 大鼠模型,選取40 只大鼠,按照隨機數字法分為對照組、模型組、復方甘草酸苷低劑量組(10 mg/kg,簡稱LD 組)、復方甘草酸苷中劑量組(20 mg/kg,簡稱MD 組)、復方甘草酸苷高劑量組(30 mg/kg,簡稱HD 組),每組8 只,按照1 mg RTX、25 ml溶劑(2.5 ml 吐溫80,2.5 ml 無水乙醇,20 ml 生理鹽水)的比例制備RTX 溶液,除對照組腹腔注射等量溶劑,其余各組均腹腔注射RTX 溶液(250 μg/kg);造模前后測定各組大鼠的足底機械痛及熱痛閾值判斷建模是否成功,造模后模型組痛閾值顯著下降,與對照組比較有統計學意義時即為模型構建成功。本實驗中32 只大鼠均建模成功。模型構建后2 w 開始給藥,給藥劑量參照人體表法計算,成年人標準體重60 kg,每日復方甘草酸苷最大用量200 mg,因此設定大鼠給藥劑量分別為10、20、30 mg/kg,復方甘草酸苷藥物用生理鹽水配制,LD、MD、HD 組按照各組給藥劑量行灌胃處理,模型組、正常組灌胃等量生理鹽水,持續灌胃2 w〔10〕。

1.3.2 大鼠機械痛閾值測定 將大鼠置于爪觸覺測試儀玻璃箱中,測試之前適應30 min,將電子觸覺測量儀對準大鼠的足底部,記錄大鼠縮足時電子觸覺測量針的刺激力度,記錄對照組、模型組、LD、MD、HD 組右后爪造模第0、3、7、10、14 天、給藥第3、7、10、14 天的機械痛覺閾值(MWT),每只大鼠測量5 次,每次間隔5 min,計算其平均值。

1.3.3 大鼠熱痛閾值測定 將大鼠置于足底熱刺激儀玻璃箱中,測試之前適應30 min,用熱輻射刺激儀照射大鼠足底部的玻璃板,記錄從照射開始到大鼠縮足所經歷的時間,記為熱縮足潛伏期(TWL),為防止大鼠燙傷將時間上限設為20 s,分別記錄對照組、模型組、LD、MD、HD 組各大鼠右后爪造模第0、3、7、10、14 天、給藥第3、7、10、14 天的TWL 值,每只大鼠測量5 次,每次間隔5 min,計算其平均值〔11〕。

1.3.4 大鼠脊髓背角標本采集 各組大鼠熱痛閾值測定結束后24 h 將大鼠麻醉,用含有4%多聚甲醛、0.25%戊二醛的0.1 mol/L 磷酸緩沖液進行心臟灌注,待大鼠四肢僵硬后低溫下取其L4-L5 段脊髓背角,3 只大鼠的脊髓背角組織用于炎癥因子測定,2 只用于透射電鏡觀察,3 只用于相應蛋白表達檢測。

1.3.5 大鼠脊髓背角炎癥因子測定 隨機取

1.3.4 中3 只大鼠的脊髓背角組織,稱重后剪碎,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)后制備成10%的勻漿液,離心取上清液,按照試劑盒說明書的操作檢測TNF-α、IL-1β、IFN-γ 的水平。

1.3.6 大鼠脊髓背角自噬情況觀察 隨機取

1.3.4 中2 只大鼠的脊髓背角組織,于2.5%戊二醛中固定過夜(4℃),用1%四氧化鋨室溫固定1 h,雙蒸水浸洗3 次后用不同濃度梯度(50%、70%、90%、100%)的乙醇溶液處理,經過丙酮脫水、環氧樹脂包埋后制成超薄切片,用3%枸櫞酸鉛染色,然后在透射電鏡下觀察脊髓背角神經元自噬情況。

1.3.7 大鼠脊髓背角自噬相關蛋白及PINK1/Parkin 信號通路相關蛋白表達測定 隨機取1.3.4 中3 只大鼠的脊髓背角組織,根據蛋白質提取試劑盒的要求對各組大鼠脊髓背角組織中的總蛋白進行提取,參照BCA 試劑盒的說明書測定其中蛋白濃度,用SDS-PAGE 分離等量蛋白質后轉移至PDVF 膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,在4℃下加入1 ∶2 000 的兔抗鼠LC3(1 ∶800)、Beclin-1(1 ∶800)、p62、PINK1(1 ∶400)、Parkin(1 ∶800)、β-actin 一抗(1 ∶1 000),于4℃冰箱中孵育過夜,經TBST 漂洗3 次,加入1 ∶1 000的羊抗兔二抗溶液,于搖床上室溫孵育2 h,經TBST 再次漂洗3 次,采用增強化學發光法顯色,以凝膠成像儀觀察條帶并拍照,并以Image-J 軟件分析各組大鼠脊髓背角組織自噬相關蛋白(LC3 Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、p62)、PINK1/Parkin 信號通路相關蛋白(PINK1、Parkin)的表達。

1.4 統計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組MWT 比較 模型組、LD 組、MD 組、HD組大鼠MWT 值在造模第3 天時出現明顯下降(P＜0.05),且在造模第10 天時達最低值,在造模第14 天時仍持續較低水平;給藥處理后,與對照組相比,不同時間點模型組大鼠MWT 值均顯著降低(P＜0.05),與模型組相比,不同時間點復方甘草酸苷各劑量組MWT 值均顯著升高(P＜0.05),且呈現一定的劑量效應關系,其中HD 組效果較優。見表1。

表1 各組造模及給藥后MWT 比較(±s,g,n=8)

表1 各組造模及給藥后MWT 比較(±s,g,n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與LD 組比較:3)P＜0.05;與MD 組比較:4)P＜0.05;與本組前一時點比較:5)P＜0.05,下表同

組別造模第0 天造模第3 天造模第7 天造模第10 天造模第14天對照組38.01±5.4338.12±5.4336.93±5.2537.84±5.4037.03±5.27模型組37.84±5.4030.63±3.871)5)19.33±2.321)5)11.82±1.481)5)12.06±0.941)LD 組38.03±5.4329.76±3.721)5)18.26±2.141)5)12.66±2.041)5)12.85±1.071)MD 組37.91±5.4130.39±3.831)5)20.03±2.431)5)12.34±2.091)5)13.39±1.161)HD 組37.72±5.3830.90±4.011)5)19.37±2.331)5)11.13±1.381)5)12.97±1.091)F/P 值0.003/1.0003.379/0.02932.204/0.00074.816/0.00090.830/0.000組別給藥第3 天給藥第7 天給藥第10 天給藥第14天對照組37.69±5.3838.07±5.4437.92±5.4237.88±5.41模型組12.38±1.161)13.26±1.341)13.91±1.411)14.20±1.461)LD 組17.66±2.041)2)18.03±2.101)2)18.98±2.261)2)20.06±2.441)2)MD 組22.03±2.771)2)3)22.88±3.011)2)3)23.69±3.041)2)3)25.27±3.311)2)3)HD 組27.59±3.691)2)3)4)28.37±3.821)2)3)4)30.82±4.231)2)3)4)31.18±4.291)2)3)4)F/P 值42.384/0.00038.816/0.00035.543/0.00032.099/0.000

2.2 各組熱痛閾值比較 模型組、LD 組、MD 組、HD 組TWL 值在造模第3 天時出現明顯升高(P＜0.05),且在造模第10 天時達最高值,在造模第14 天時仍持續較高水平;給藥處理后,與對照組相比,給藥不同時間點模型組TWL 值顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,復方甘草酸苷各劑量組TWL值顯著降低(P＜0.05),且呈現一定的劑量效應關系,其中高劑量組效果較優。見表2。

表2 各組造模及給藥后TWL 比較(±s,s,n=8)

表2 各組造模及給藥后TWL 比較(±s,s,n=8)

組別造模第0 天造模第3 天造模第7 天造模第10 天造模第14天對照組7.31±0.607.20±0.606.99±0.588.02±0.687.84±0.65模型組8.07±0.6715.33±1.271)5)22.17±1.841)5)25.11±2.091)5)23.37±1.941)LD 組7.06±0.5815.06±1.251)5)23.06±1.921)5)24.60±2.051)5)23.98±1.991)MD 組8.01±0.6614.97±1.241)5)22.80±1.901)5)25.39±2.111)5)24.06±2.001)HD 組7.90±0.6515.28±1.271)5)23.79±1.981)5)24.68±2.051)5)23.11±1.921)F/P 值2.590/0.06847.468/0.00085.873/0.00081.123/0.00078.992/0.000組別給藥第3 天給藥第7 天給藥第10 天給藥第14天7.35±0.567.44±0.576.89±0.537.39±0.61模型組23.88±1.831)23.06±1.771)22.94±1.761)22.37±1.861)LD 組21.20±1.631)2)20.14±1.541)2)19.49±1.491)2)17.94±1.491)2)MD 組18.37±1.411)2)3)17.26±1.321)2)3)16.84±1.291)2)3)15.06±1.251)2)3)HD 組15.44±1.181)2)3)4)14.39±1.101)2)3)4)13.55±1.041)2)3)4)12.33±1.021)2)3)4)F/P 值104.447/0.000102.049/0.000112.372/0.000對照組92.438/0.000

2.3 各組脊髓背角炎癥因子比較 與對照組相比,模型組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,復方甘草酸苷各劑量組脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平均顯著降低(P＜0.05),且呈現一定的劑量效應關系,其中高劑量組效果較優。見表3。

表3 各組脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平及脊髓背角組織神經自噬相關蛋白表達比較(±s,n=3)

表3 各組脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平及脊髓背角組織神經自噬相關蛋白表達比較(±s,n=3)

組別TNF-α(ng/mg)IL-1β(ng/mg)IFN-γ(ng/mg)LC3Ⅱ/LC3ⅠBeclin-1/β-actinp62/β-actin對照組2.46±0.270.87±0.090.96±0.110.22±0.040.36±0.050.94±0.08模型組10.71±1.091))2.54±0.281)2.69±0.281)1.02±0.171)1.07±0.111)0.19±0.031)LD 組8.03±0.891)2)1.97±0.211)2)2.08±0.231)2)0.77±0.151)2)0.86±0.171)2)0.41±0.041)2)MD 組6.25±0.591)2)3)1.50±0.161)2)3)1.61±0.171)2)3)0.56±0.111)2)3)0.67±0.081)2)3)0.59±0.061)2)3)HD 組4.44±0.481)2)3)4)1.15±0.121)2)3)4)1.23±0.131)2)3)4)0.34±0.071)2)3)4)0.44±0.071)2)3)4)0.77±0.091)2)3)4)F/P 值57.907/0.00038.813/0.00037.661/0.00037.257/0.00038.255/0.000105.218/0.000

2.4 各組脊髓背角透射電鏡觀察 對照組脊髓背角神經元細胞核、內質網、溶酶體、線粒體形態基本正常;與對照組相比,模型組核膜凸凹不平,細胞核固縮,溶酶體形態異常,線粒體腫脹、變形甚至裂解,有明顯的自噬囊泡存在,可見到自噬囊泡中高電子密度的自噬體;與模型組相比,復方甘草酸苷各劑量組脊髓背角神經元自噬情況均得到改善,其中高劑量組改善效果較好。見圖1。

圖1 各組脊髓背角透射電鏡觀察(×1 000)

2.5 各組脊髓背角神經自噬相關蛋白表達比較與對照組相比,模型組脊髓背角組織LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 表達顯著升高(P＜0.05),p62 表達顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,復方甘草酸苷各劑量組脊髓背角組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 表達水平均降低(P＜0.05),p62 表達水平均升高(P＜0.05),且呈現一定的劑量效應關系,其中高劑量組效果最優。見表3、圖2。

圖2 各組脊髓背角組織神經自噬相關蛋白及PINK1/Parkin 信號通路相關蛋白表達

2.6 各組脊髓背角PINK1/Parkin 信號通路相關蛋白表達比較 與對照組相比,模型組脊髓背角組織PINK1、Parkin 蛋白表達升高(P＜0.05);與模型組相比,復方甘草酸苷各劑量組大鼠脊髓背角組織PINK1、Parkin 蛋白表達水平均降低(P＜0.05),且呈現一定的劑量效應關系,其中高劑量組效果最優。見圖2、表4。

表4 各組脊髓背角組織PINK1/Parkin信號通路相關蛋白表達(±s,n=3)

表4 各組脊髓背角組織PINK1/Parkin信號通路相關蛋白表達(±s,n=3)

組別PINK1/β-actinParkin/β-actin對照組0.29±0.020.34±0.03模型組1.06±0.111)1.22±0.111)LD 組0.79±0.071)2)0.91±0.101)2)MD 組0.61±0.061)2)3)0.69±0.091)2)3)HD 組0.48±0.051)2)3)4)0.51±0.061)2)3)4)F/P 值55.487/0.00051.281/0.000

3 討 論

RTX 是辣椒素的超能類似物,能誘發類似PHN的疼痛,研究發現腹腔注射RTX 會使大鼠出現與PHN 臨床表現相似的痛覺過敏、痛覺超敏,且構建的PHN 大鼠模型安全且可靠〔12〕,本研究結果顯示,造模第3 天時MWT 值出現明顯下降,TWL 值出現明顯升高,這與PHN 患者臨床表現類似,表明PHN大鼠模型構建成功。臨床治療PHN 的方法主要有神經阻滯、神經調節、介入治療等,研究發現加服地塞米松等糖皮質激素可顯著減輕后遺痛的發生〔12,13〕,但患者常會因糖皮質激素類藥物易產生諸多不良反應而拒絕使用,因此探究治療PHN 的相關藥物仍是研究中的熱點。復方甘草酸苷化學結構類似于皮質類固醇,具有抑制病毒增殖、滅活病毒、提高機體抗病毒能力、抗炎、免疫調節等作用,研究表明在治療早期服用復方甘草酸苷可有效緩解PHN病情,治愈率及有效率較好,且患者耐受性好〔14〕。本研究結果表明復方甘草酸苷對PHN 大鼠后遺痛具有一定的緩解作用,但其作用機制仍不清晰。

PHN 發病與帶狀皰疹病毒引起的感覺神經大面積損傷、急性神經炎癥密切相關,脊髓在神經性病理疼痛發生發展中起到重要作用,越來越多研究發現脊髓背角炎癥及相關神經細胞過度自噬在PHN疼痛、感覺異常等癥狀中發揮重要作用〔15〕。細胞自噬是細胞利用自噬體吞噬異物及受損的細胞器對細胞內物質進行周轉的一種生理活動,自噬活動穩定對調節細胞內部穩定、維持細胞正常生命活動有重要意義,但炎癥反應、神經系統損傷等引起的自噬紊亂常常會對機體造成不利影響〔16,17〕。LC3 存在于自噬體分離膜上,是自噬體形成的關鍵蛋白,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可反映自噬體形成程度;Beclin-1 是能調控自噬前體的形成的一種基因,在自噬的啟動中發揮重要作用〔18〕。本研究結果表明,脊髓中的炎癥反應與神經元細胞自噬紊亂與PHN 密切相關,經過復方甘草酸苷治療的大鼠脊髓背角中的炎癥因子表達水平顯著下降,神經元自噬紊亂得到一定的緩解,表明復方甘草酸緩解PHN 病情的機制可能與抑制脊髓背角炎癥反應及調節相關神經細胞自噬有關。

PINK1/Parkin 信號通路與細胞自噬密切相關,在維持線粒體功能與代謝中發揮重要作用,PINK1與Parkin 之間共同作用調控線粒體自噬活性,其中PINK1 位于Parkin 上游,正常情況下PINK1 含量較低,當線粒體發生損傷時,PINK1 受到活化,進一步誘導線粒體自噬過程〔19〕。Chen 等〔20〕研究發現,激活PINK1/Parkin 信號通路后,自噬相關基因及蛋白表達顯著降低,自噬點顯著減少。本文研究結果提示,復方甘草酸苷具有一定的抑制PINK1/Parkin 信號通路激活的作用,可能與其緩解PHN 病情、抑制脊髓背角炎癥反應及調節相關神經細胞自噬有關。

綜上,復方甘草酸苷能緩解PHN 大鼠的疼痛行為學,降低PHN 大鼠脊髓背角相關神經自噬活性及炎性因子的表達,可能與抑制PINK1/Parkin 信號通路有關,但本文未進行相關通路激活劑進行對照試驗,因此仍需深入研究。