食源性晚期糖基化終末產物上調TLR4/MyD88/NF-κB信號通路對小鼠非酒精性脂肪肝炎癥反應的影響

劉丹鋒 蔡魏 邱劍 孫夏林 (九江市第三人民醫院 內分泌科,江西 九江 33000; 普外科)

脂肪肝是指肝細胞內脂肪堆積過多而影響肝臟的正常功能的病變,根據誘發成因可分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFL),其與肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟損害疾病密切相關〔1〕。晚期糖基化終產物(AGEs)是糖類和蛋白質結合的產物,AGEs 在糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病發生中發揮重要的作用,AGEs 能影響NAFL 發生發展〔2〕。Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(MyD88)、核轉錄因子(NF)-κB 的信號通路是機體發生炎癥反應的經典通路,TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路活化可促進炎癥反應,Ham 等〔3〕研究認為丁香酸可下調炎癥基因(TLR4,MyD88,NF-κB)的表達而抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪變性和炎癥作用。本研究旨在觀察食源性AGEs 對TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路及肝臟炎癥反應的影響,探討食源性AGEs 引起NAFL發生作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物:C57BL/6J 小鼠60 只,雄性,體重(20±2)g,本研究通過了動物倫理委員會批準,符合道德倫理要求。實驗試劑:4% 甲醛和10%甲醛購自聊城芫澤化工產品有限公司,石蠟、伊紅染液、蘇木素染液均購自甘肅隆鑫商貿有限公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)和TUNEL 試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司。總RNA 提取試試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自Promega 公司,PCR 引物由上海達科為生物技術公司合成,GAPDH 購自中杉金橋生物技術有限公司。TLR4 一抗(批號:sc-243052)購自Santa 公司,MyD88 一抗(批號:4127S)購自上海優寧維生物科技股份有限公司,核因子(NF)-κB 一抗(批號:XY-ABS194)購自上海熹垣生物科技有限公司,甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)購自Cell signaling 公司(批號:5648T)。實驗儀器:光學顯微鏡屬日本OLYMPUS 公司產品,實時熒光定量PCR 儀屬Applied Biosystems 產品,高速離心機屬德國Eppendorf 公司產品。

1.2 AGEs 制備 外源性AGEs 制備:將濃度為100 mmol/L的丙酮醛(MG)和0.1 mol/L 的牛血清白蛋白(BSA)溶于PBS 中(MG-BSA 溶液),37℃恒溫箱中錫紙外包避光孵育72 h,另取濃度為0.1 mol/L的BSA 溶于PBS 放入恒溫箱中孵育相同時間作為對照。72 h 后,取出兩種孵育溶液,發現作為對照的BSA 溶液仍是無色透明的,沒有變化,而MG-BSA 溶液由黃色變為深棕色,可行下一步實驗操作。將MG-BSA 溶液移入透析袋中,排盡袋內空氣后封閉袋口,置入碳酸氫銨緩沖液中除去未結合雜質。取出MG-BSA 溶液移入培養皿中,-80℃冰箱中冷凍,48 h 后取出培養皿,獲得凍干MG-BSA粉末,稱取MG-BSA 粉末10 g,加入10 kg 粉狀飼料中均勻攪拌,然后通過制粒機壓制成顆粒(外源性AGEs 飼料)備用。食源性AGEs 制備:將普通飼料用電烤箱中加熱,設置溫度為120℃,加熱15 min,制成食源性AGEs 飼料,保存備用。

1.3 實驗分組與喂養 取60 只小鼠隨機分為空白對照組、外源性AGEs 組、食源性AGEs 組和陽性對照組,每組15 只。空白對照組喂養普通飼料,外源性AGEs 組喂養外源性AGEs 飼料,食源性AGEs 組喂養食源性AGEs 飼料,陽性對照組喂養高脂飼料,連續喂養12 w 后觀察相關指標變化情況。

1.4 飼料AGEs 含量檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測飼料AGEs 含量。操作步驟如下:準確稱取每組飼料1 g,并加入100 ml PBS 溶解,取標準品稀釋液,配制濃度為8 000、2 666、888、296 ng/ml、98 ng/ml 的標準品梯度濃度稀釋液,空白孔加入PBS 作為對照,酶標儀設定波長為450 nm測定吸光度,根據標準曲線計算各組AGEs 含量,每組飼料重復3 次測定,結果取平均值。

1.5 血清學指標測定 所有小鼠末次飼料喂養后,禁食12 h 后,采用乙醚麻醉,眼下靜脈叢取血,在3 000 r/min離心15 min,分離出血清,放置-4℃醫用冰箱中保存備用。采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、谷草轉氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)含量,用ELISA 檢測小鼠血清炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2、IL-6 含量。

1.6 肝臟組織病理切片觀察 各組采集完眼下靜脈叢血后,立即處死小鼠,取出其肝臟組織,切取部分組織用10%甲醛固定48 h,脫水、包埋、切片、脫蠟后,采用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察各組肝臟病理組織,用油紅染色觀察各組肝細胞脂肪變性程度。

1.7 蛋白質免疫印跡(WB)檢測肝臟組織TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白基因表達 取各組肝臟組織1 g 放入研磨器中,加入液氮粉碎研磨,利用組織裂解液進行裂解,Trizol 法提取組織總蛋白,使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量測定,按比例加入4×蛋白上樣緩沖液,95℃變性5 min,置于-20℃保存備用。設置濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉印。取氟乙烯膜用洗滌緩沖液洗膜5 min,共3 次,封閉、室溫搖床孵育2 h。洗膜后先后加入一抗工作液(TLR4、MyD88、NF-κB 抗體)和二抗工作液,進行一抗孵育和二抗孵育后。將新鮮配制的化學發光液滴加到氟乙烯膜表面,轉移至成像分析系統暗箱中曝光,采集圖像并分析。蛋白定量:以相對光密度值代表蛋白相對表達量,以GAPDH 為內參進行分析,實驗至少重復3 次。

1.8 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測肝臟組織TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白基因表達取各組肝臟組織1 g 放入研磨器中,加入液氮粉碎研磨,利用組織裂解液進行裂解,Trizol 法提取組織總RNA,按照PCR 逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應,PCR 引物序列5′-3′,TLR4 上游:ACCTCGAGTGGGAGGACAAT、下游: TGAGGTTAGAAGCCTCGTGC,150 bp。MyD88 上游:ATACGGAACCAGCAGAAACAG、下游: TATCAATGGGGCAGTAGCAGA,131 bp。NF-κB 上游:AACAGCAGATGGCCCATACCT、下游:ACGCTGAGGTCCATCTCCTTG,130 bp。GAPDH 上游: GAAGGTGAAGGTCGGAGT、下游:GAAGATGGTGATGGGATTTC,138 bp。設置好qRTPCR 體系,設置反應條件:95℃5 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃35 s,共40 個循環。以2-ΔΔCt公式計算TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行單因素方差分析、t檢驗;方差不齊采用Kruskal-WallisH檢驗,兩兩比較行TamhaneT2檢驗。

2 結 果

2.1 各組飼料AGEs 含量 空白對照組、外源性AGES 組、食源性AGES 組、陽性對照組飼料AGEs含量〔(513.29 ± 76.00)、(1 741.96 ± 113.00)、(1 122.98±84.99)、(844.99±82.00)ng/ml〕差異具有統計學意義(F=429.943,P=0.000)。與空白對照組和陽性對照組比較,外源性AGEs 組和食源性AGEs 組飼料AGEs 含量均升高,差異具有統計學意義(均P＜0.05),且外源性AGEs 組顯著高于食源性AGEs 組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組肝臟病理切片觀察 空白對照組肝小葉結構完整,肝細胞排列整齊,未見脂肪變性;食源性AGEs 組可見少量細小的脂肪滴空泡;外源性AGEs組和陽性對照組可見脂肪滴空泡,陽性對照組更明顯,見圖1。油紅染色顯示,與空白對照組比較,外源性AGEs 組、食源性AGEs 組和陽性對照組脂滴增加,陽性對照組更為明顯,見圖2。

圖2 各組肝臟油紅染色(×200)

2.3 食源性AGEs 對血脂及肝功能指標的影響4 組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST 及ALT 含量差異均有統計學意義(均P＜0.05)。血清TG、TC、LDL-C、AST 及ALT 表達水平在空白對照、食源性AGEs 組、外源性AGEs 組和陽性對照組中均依次升高,差異具有統計學意義(均P＜0.05)。與空白對照組比較,食源性AGEs 組、外源性AGEs 組和陽性對照組血清HDL-C 表達水平降低,差異具有統計學意義(均P＜0.05),且外源性AGEs 組和陽性對照組低于食源性AGEs 組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1、表2。

表1 4 組血脂指標表達水平比較(±s,n=15)

表1 4 組血脂指標表達水平比較(±s,n=15)

與空白對照組比較:1)P＜0.05;與食源性AGEs 組比較:2)P＜0.05;與外源性AGEs 組比較:3)P＜0.05;4)Kruskal-wallis H 檢驗;下表同

組別TG(mmol/L)TC(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)0.86±0.236.14±0.613.52±0.391.51±0.33食源性AGEs 組1.43±0.221)10.81±0.881)7.73±0.471)0.94±0.341)外源性AGEs 組1.84±0.291)2)14.25±1.201)2)9.32±0.531)2)0.68±0.281)2)陽性對照組2.51±0.391)2)3)19.58±1.451)2)3)12.46±0.711)2)3)0.49±0.361)2)F 值P 值空白對照組50.155 0.0004)55.336 0.0004)718.876 0.000 26.751 0.000

2.4 食源性AGEs 對血清炎癥因子的影響 4 組血清TNF-α、IL-2 及IL-6 表達水平差異有統計意義(均P＜0.05)。與空白對照組比較,食源性AGEs組、外源性AGEs 組和陽性對照組血清TNF-α、IL-2及IL-6 表達水平均升高,差異具有統計學意義(均P＜0.05),外源性AGEs 組和陽性對照組高于食源性AGEs 組,差異具有統計學意義(均P＜0.05),陽性對照組高于外源性AGEs 組,差異具有統計學意義(均P＜0.05)。見表2。

表2 4 組肝功能指標血清炎癥因子表達水平比較(±s,n=15)

表2 4 組肝功能指標血清炎癥因子表達水平比較(±s,n=15)

組別AST(U/L)ALT(U/L)TNF-α(mg/kg)IL-2(mg/kg)IL-6(mg/kg)0341.53±8.69食源性AGEs 組60.87±5.491)51.27±10.801)80.73±15.361)67.73±9.351)48.73±6.711)外源性AGEs 組98.07±5.811)2)62.60±5.291)2)91.20±18.471)2)75.93±9.151)2)56.27±10.351)2)陽性對照組114.60±6.661)2)3)80.00±7.151)2)3)99.40±19.311)2)3)96.33±7.891)2)3)71.47±9.321)2)3)F 值P 值空白對照組32.27±4.3544.67±2.6468.67±16.5958.47±8.647.293 0.000 70.753 0.000 8.660 0.000 52.466 0.000 33.146 0.000

2.5 食源性AGEs 對肝組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響 4 組肝組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及其mRNA 表達水平差異均有統計學意義(均P＜0.05)。與空白對照組比較,食源性AGEs 組、外源性AGEs 組和陽性對照組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白及其mRNA 表達水平均升高,差異具有統計學意義(均P＜0.05),且陽性對照組肝組織TLR4、MyD88、NF-κB 及MyD88mRNA 表達水平顯著高于食源性AGEs 組和外源性AGEs 組,差異具有統計學意義(均P＜0.05)。見表3。

表3 4 組TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白及mRNA 表達水平比較(±s,n=15)

表3 4 組TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白及mRNA 表達水平比較(±s,n=15)

組別TLR4MyD88NF-κBTLR4 mRNAMyD88 mRNANF-κ B mRNA空白對照組0.82±0.100.62±0.090.95±0.130.68±0.070.54±0.080.70±0.11外源性AGEs 組1.08±0.141)0.77±0.171)0.85±0.151)0.85±0.151)0.68±0.141)0.83±0.151)食源性AGEs 組1.11±0.181)0.87±0.131)0.95±0.111)0.95±0.111)0.75±0.121)0.86±0.161)陽性對照組1.36±0.231)2)3)1.13±0.241)2)3)0.99±0.171)2)3)0.99±0.171)1.00±0.221)2)3)0.94±0.181)F 值P 值33.710 0.000 36.090 0.000 13.197 0.000 30.225 0.000 36.400 0.000 6.781 0.001

3 討 論

研究顯示,脂肪肝發病多與過度飲酒、營養過剩、胰島抵抗等危險因素相關〔4～6〕,我國脂肪肝伴肝功能損害的發病人數不斷增加且有年輕化趨勢〔7〕。NAFL 病因多樣且復雜,目前尚未明確其發病機制,不斷探索、發現NAFL 病因及發病機制,對實施有效的干預措施以預防和控制疾病發生和發展具有重要的意義。

以往多項研究通過高脂誘導小鼠制備NAFL 模型均有成功的先例〔8,9〕。AGEs 是還原糖的羧基與大分子物質如核酸、蛋白質等的氨基結合后經過重排脫水等反應形成的不可逆產物。食物中AGEs 含量差異除了與原材料有關外,與食物的加工方式亦有極大關聯,因此本研究通過化學反應方式制備外源性AGEs 及用電烤箱烘烤飼料以獲取食源性AGEs,旨為實驗研究提供多種含AGEs 原材料。本文結果提示,飼料烘烤后可產生AGEs 增加,其可用作于食源性AGEs 飼料。本文結果表明,小鼠在喂養外源性AGEs 飼料、食源性AGEs 飼料和高脂飼料后,肝臟組織發生不同程度的脂肪變性。以往研究顯示AGE 受體(RAGE)是細胞表面分子的免疫球蛋白超家族成員之一,與AGE 及蛋白質分子相互作用參與炎癥反應,高水平的AGE 可促進RAGE 的表達,誘導細胞信號轉導與促進炎癥性疾病的發生發展〔10〕,肝臟組織發生炎癥反應可能是加重其脂肪變性的重要原因。本文結果提示,食源性AGEs、外源性AGEs 及高脂飲食均能上調炎癥因子表達水平,進一步證實了NAFL 發生與炎癥反應機制高度相關,這一結果與唐東暉等〔11〕、何峰等〔12〕研究結果相一致。本文結果表明,脂肪變性后所造成的血清TG、TC、LDL-C、AST、ALT、HDL-C 表達水平的高低取決于小鼠脂肪肝變性的嚴重程度。

TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路參與多種疾病病理生理過程,在炎癥性疾病中扮演著重要的作用。Xu 等〔13〕研究認為利拉魯肽聯合人臍帶間充質干細胞可通過調節TLR4/NF-κB 炎癥途徑和氧化應激改善NAFL 大鼠肝臟病變。El-Kashef 等〔14〕認為硫代乙酰胺顯著增加NF-κB 表達,增強TLR4 和NLPR3炎癥小體的產生而誘導小鼠急性肝損傷作用。青蒿琥酯能抑制TLR4 及MyD88 表達改善NAFL 小鼠肝臟脂肪變性作用〔15〕。以上研究結果提示,NAFL 發病與TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路活化相關,TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路表達升高可促進炎癥反應,對肝臟脂肪變性具有消極作用。本研究結果提示,食源性AGEs、外源性AGEs 和高脂飼料均能上調TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路表達,高脂飼料對TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的作用更明顯。

綜上所述,食源性AGEs 促進小鼠炎癥反應,加重小鼠肝臟脂肪變性,其可能作用機制與上調TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路表達相關。然而本研究仍有不足之處,由于食源性的AGEs 含量無法準確確定,本研究尚未對食源性AGEs 劑量進行討論,此外,外源性AGEs 組TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白及其mRNA 表達略高于食源性AGEs組,但均無統計學意義,因此上述結論仍需要開展相關實驗進一步證實。