蘇木提取液調控lncRNA PCNA-AS1對乳腺癌細胞T-47D增殖、凋亡和遷移的影響

賈海明 李英 白文輝 李宗龍( 青海紅十字醫院乳腺科,青海 西寧 80000;2 綿陽市第三人民醫院乳腺科)

據統計,2018年全球乳腺癌新確診病例高達210 萬例,死亡病例達63 萬例〔1〕。雖然化療、放療和內分泌治療在消除腫瘤細胞、抑制腫瘤生長、減少乳腺癌復發方面表現出一定優勢,但往往伴隨著較大的副作用和耐藥性。因此,尋找具有抗腫瘤活性的天然產物可能為乳腺癌治療提供替代策略。蘇木是一種廣泛分布于東南亞的藥用植物,其心材入藥具有活血散瘀、祛風止痛功效。現代藥理學研究表明,蘇木提取液還可誘導胃癌、口腔癌、頭頸癌凋亡、抑制細胞生長〔2～4〕。然而蘇木提取液在乳腺癌中抗腫瘤作用鮮有報道。增殖細胞核抗原反義RNA(PCNA-AS)1 基因是最近發現的長鏈非編碼(lnc)RNA,有報道稱結直腸癌中PCNA-AS1 異常表達與腫瘤浸潤及TNM 分期顯著相關〔5〕。PCNA-AS1 表達增加促進肝癌細胞增殖〔6〕。然而,PCNA-AS1 在乳腺癌中的功能仍不清楚。本研究通過體外細胞實驗探討蘇木提取液對乳腺癌細胞T-47D 增殖、凋亡、遷移的影響,研究其抗腫瘤作用是否與調控PCNA-AS1 相關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 乳腺癌細胞T-47D 購于中國科學院上海細胞庫;PCNA-AS1 小干擾RNA(si-NC)及其對照(si-PCNA-AS1)、PCNA-AS1 過表達質粒(pcDNA-PCNA-AS1)及其對照(pcDNA)購于廣州銳博生物公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司;山羊抗兔IgG 二抗、兔源B 細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相關X蛋白(Bax)、GAPDH 蛋白購于美國CST 公司;MMLV 逆轉錄酶、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購于大連Takara 生物公司。

1.2 蘇木提取液的制備 參照文獻〔2〕方法制備蘇木提取液,取即生藥蘇木煎煮3 次,每次40 min,合并煎液后將其沉淀、濃縮,3 000 r/min 離心20 min。然后超濾,分離提純制得。

1.3 細胞培養、轉染和分組 T-47D 細胞接種含有RPMI1640 培養基(添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗、0.2 U/ml 胰島素)的培養瓶,放入37℃、CO2體積分數5%濕潤培養箱中培養,每兩天換液1 次,80%融合時以胰酶消化細胞按照1 ∶3比例傳代。正常培養的T-47D 細胞為對照組。用含25、50、100 μg/ml蘇木提取液的培養液孵育細胞48 h分別為蘇木低劑量組、中劑量組、高劑量組,按照下述方法步驟檢測T-47D 細胞增殖、遷移、凋亡及PCNA-AS1 表達變化。將對數期T-47D 細胞接種6 孔板,細胞60%融合時利用Lipofectamine 2000 將si-NC、si-PCNA-AS1 分別轉染細胞,收轉染48 h 細胞按照RT-qPCR 步驟檢測轉染效果。轉染si-NC、si-PCNA-AS1 的細胞為si-NC 組、si-PCNA-AS1 組。用含100 μg/ml蘇木提取液的培養液孵育轉染si-NC、si-PCNA-AS1 細胞48 h 分別為蘇木高劑量+pcDNA組、蘇木高劑量+ pcDNA-PCNA-AS1。

1.4 CCK-8 實驗檢測細胞活力 將轉染48 h 或未轉染T-47D 細胞接種96 孔板,按照實驗分組加入不同劑量的蘇木提取液,孵育細胞48 h 后,更換為新鮮完全培養基,每孔中添加10 μl CCK-8 溶液在培養箱中繼續孵育2 h。在450 nm 波長處用酶標儀測定各孔光密度(OD)值。細胞存活率以實驗組和對照組OD 值比值表示。

1.5 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成 每組取5×102個細胞鋪于6 孔板,放入培養中常規培養,當出現肉眼可見菌落形成時用4%多聚甲醛固定10 min,再用0.1%結晶紫染色30 min,顯微鏡下統計菌落形成數(大于50 個細胞菌落為有效菌落)。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收獲上述各組細胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次,用1×結合緩沖液重懸。按照凋亡檢測試劑盒說明用Annexin V-FITC/PI 對細胞進行染色。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率為早期凋亡(Annexin V-FITC 陽性,PI 陰性)率和晚期凋亡(Annexin V-FITC 陽性,PI 陽性)率之和。

1.7 Western 印跡檢測Bcl-2 和Bax 蛋白表達 RIPA 裂解緩沖液裂解細胞,4℃下1 000 r/min 離心15 min收集上清,用蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量。取等量的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后轉移到硝酸纖維素膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h,再用特異性一抗(稀釋比例均為1 ∶2 000)在4℃下與膜反應過夜,再用相應的二抗在室溫孵育膜1 h。利用化學發光試劑進行顯色反應,以Image J 軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值

1.8 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 每組取5×105個細胞鋪于6 孔板,當細胞生長至融合為一層時用無菌移液槍槍頭垂直在細胞表面劃一條直線,記為劃痕0 h 并拍照。放入37℃、CO2體積分數5%培養箱24 h 為劃痕24 h 并拍照。劃痕愈合率=(0 h劃痕距離-24 h 劃痕距離)/0 h 劃痕距離×100%

1.9 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測PCNA-AS1 表達 TRIzol 試劑提取各組細胞總RNA,使用M-MLV逆轉錄酶合成第一鏈cDNA,再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒熒光定量PCR 上進行RT-qPCR。以GAPDH 為內參,2-ΔΔCt法計算PCNA-AS1 表達量。PCNA-AS1 上游引物5′-TTTGGACATACTGGTGAGG-3′,下游5′-A AGGTGTTGGAGGCACTC-3′;GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.10 統計學方法 采用SPSS18.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 蘇木提取液對T-47D 增殖凋亡的影響 相較于對照組,蘇木低、中、高劑量組T-47D 細胞存活率、克隆形成數、Bcl-2 蛋白表達量顯著降低(P＜0.05),Bax 蛋白表達量、凋亡率顯著升高(P＜0.05)。且蘇木低、中、高劑量組3 組間T-47D 細胞上述指標差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖1、表1、圖2。

圖1 蘇木提取液對T-47D 凋亡的影響

圖2 蘇木提取液對T-47D 凋亡蛋白表達的影響

2.2 蘇木提取液對T-47D 遷移及PCNA-AS1 表達的影響 相較于對照組,蘇木低、中、高劑量組T-47D細胞劃痕愈合率降低(P＜0.05),PCNA-AS1表達量降低,差異均有統計學意義(均P＜0.05),見表1。

表1 蘇木提取液對T-47D 細胞存活率、克隆形成、凋亡、T-47D 遷移及PCNA-AS1 表達的影響(±s,n=3)

表1 蘇木提取液對T-47D 細胞存活率、克隆形成、凋亡、T-47D 遷移及PCNA-AS1 表達的影響(±s,n=3)

與對照組比較:1)P＜0.05;與蘇木低劑量組比較,2)P＜0.05;與蘇木中劑量組比較,3)P＜0.05

分組存活率(%) 克隆形成數(個) 凋亡率(%)BaxBcl-2PCNA-AS1劃痕愈合率(%)10.78±0.060.97±0.0666.27±3.67蘇木低劑量組86.52±3.671)106.33±6.181)10.29±0.511)0.26±0.021)0.62±0.041)0.80±0.041)50.76±2.571)蘇木中劑量組 68.24±3.331)2) 82.33±5.731)2) 15.73±0.781)2) 0.44±0.031)2)0.42±0.031)2)0.66±0.031)2) 43.22±1.861)2)蘇木高劑量組 47.82±2.801)2)3) 65.67±5.251)2)3) 23.34±0.861)2)3) 0.64±0.041)2)3) 0.23±0.021)2)3) 0.33±0.021)2)3) 35.00±1.551)2)3)F 值190.19853.706370.463190.400105.523136.00081.835 P 值對照組100.00±0.00125.00±7.356.54±0.340.14±0.0 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

2.3 干擾PCNA-AS1 對T-47D 增殖凋亡的影響相較于si-NC 組,si-PCNA-AS1 組T-47D 細胞存活率、克隆形成數、Bcl-2 蛋白表達量顯著降低(P＜0.05),Bax 蛋白表達量、凋亡率顯著升高(P＜0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 干擾PCNA-AS1 對T-47D 凋亡的影響

圖4 干擾PCNA-AS1 對T-47D 凋亡蛋白表達的影響

2.4 干擾PCNA-AS1 對T-47D 遷移的影響 相較于si-NC 組,si-PCNA-AS1 組T-47D 細胞PCNA-AS1 表達量顯著降低,劃痕愈合率顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 干擾PCNA-AS1 對T-47D 存活率、克隆形成及凋亡、T-47D 遷移的影響(±s,n=3)

表2 干擾PCNA-AS1 對T-47D 存活率、克隆形成及凋亡、T-47D 遷移的影響(±s,n=3)

組別存活率(%) 克隆形成數(個) 凋亡率(%)BaxBcl-2PCNA-AS1 劃痕愈合率(%)10.78±0.060.98±0.0566.33±3.74 si-PCNA-AS1 組54.46±2.9869.67±5.7920.84±0.790.53±0.040.31±0.020.37±0.0235.68±2.24 t 值26.6499.50628.39316.38312.87119.62012.177 P 值si-NC 組100.00±0.00 124.67±8.186.54±0.370.14±0.0 0.0000.0010.0000.0000.0000.0000.000

2.5 過表達PCNA-AS1 對蘇木提取液處理的T-47D增殖凋亡的影響 相較于蘇木高劑量+pcDNA 組,蘇木高劑量+pcDNA-PCNA-AS1 組T-47D 細胞存活率、克隆形成數、Bcl-2 蛋白表達量升高,Bax 蛋白表達量、凋亡率降低,差異均具有統計學意義(均P＜0.05)。見表3、圖5、圖6。

圖5 過表達PCNA-AS1 對蘇木提取液處理的T-47D 凋亡的影響

圖6 過表達PCNA-AS1 對蘇木提取液處理的T-47D 凋亡蛋白表達的影響

表3 過表達PCNA-AS1 對蘇木提取液處理的T-47D 細胞存活率、克隆形成凋亡及遷移的影響(±s,n=3)

表3 過表達PCNA-AS1 對蘇木提取液處理的T-47D 細胞存活率、克隆形成凋亡及遷移的影響(±s,n=3)

組別存活率(%) 克隆形成數(個) 凋亡率(%)BaxBcl-2PCNA-AS1 劃痕愈合率(%0.23±0.020.33±0.0234.98±1.62蘇木高劑量+pcDNA-PCNA-AS1 組 92.07±4.33 110.00±6.68 7.68±0.480.20±0.020.63±0.050.85±0.0555.80±2.64 t/P 值14.773/0.000 9.440/0.001 26.626/0.000 14.152/0.000 12.865/0.000 16.725/0.000 11.642/0.000蘇木高劑量+pcDNA 組48.09±2.80 65.67±4.64 23.36±0.900.64±0.05)

2.6 過表達PCNA-AS1 對蘇木提取液處理的T-47D遷移的影響 相較于蘇木高劑量+pcDNA 組,蘇木高劑量+pcDNA-PCNA-AS1 組T-47D 細胞PCNAAS1 表達量和劃痕愈合率顯著升高(P＜0.05)。見表3。

3 討 論

文獻證實蘇木活性化合物巴西木素、氧化巴西木素與順鉑聯合可協同誘導結腸癌細胞凋亡和周期阻滯〔7〕。氧化巴西木素對皮膚癌細胞具有顯著毒性作用〔8〕。蘇木乙酸乙酯提取物通過激活活性氧途徑促進急性髓性白血病細胞分化、誘導細胞凋亡〔9〕。蘇木查耳酮還可誘導caspase 依賴和凋亡誘導因子(AIF)依賴性人結腸癌細胞凋亡〔10〕。本研究提示,蘇木提取液顯著降低T-47D 細胞存活率和克隆形成能力,抑制細胞遷移,并呈劑量依賴效應。凋亡是抗腫瘤藥物誘導細胞死亡的最重要原因。Bax 和Bcl-2 是評估細胞凋亡的重要信號,促凋亡蛋白Bax 表達增加、抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低可有效促進線粒體釋放凋亡效應因子并誘導凋亡發生〔11〕。Naik Bukke 等〔12〕研究表明巴西木素A 通過調控Bcl-2 蛋白表達可誘導乳腺癌細胞MCF-7 凋亡。本研究說明,蘇木提取液可能通過線粒體途徑誘導T-47D 細胞凋亡。

越來越多研究表明lncRNA 表達異常在腫瘤的啟動、進展和轉移中發揮關鍵作用〔13〕。PCNA-AS1位于染色體20p12.3,研究指出非小細胞肺癌組織中PCNA-AS1 表達上調,與晚期TNM 分期呈正相關,敲減PCNA-AS1 顯著抑制非小細胞肺癌細胞增殖、細胞周期進程,抑制體內腫瘤形成〔14〕。此外,PCNA-AS1 高表達還與胃癌細胞的侵襲表型相關〔15〕。本研究發現,轉染si-PCNA-AS1 干擾PCNAAS1 表達顯著抑制T-47D 細胞存活、克隆形成和遷移能力,并誘導細胞凋亡。既往研究證實在乳腺癌中多種中藥化合物的抗腫瘤作用與調控lncRNA 表達有關,如槐耳提取物通過下調lncRNA H19 表達抑制乳腺癌細胞存活率并誘導細胞凋亡〔16〕。黃芩素的抗腫瘤作用與上調lncRNA 配對盒基因8 反義RNA1(PAX8-AS1)表達相關〔17〕。本研究提示,蘇木提取液可能通過調控PCNA-AS1 表達進而影響乳腺癌細胞T-47D 增殖、凋亡和遷移。下調PCNA-AS1表達是介導蘇木提取液對乳腺癌細胞T-47D 發揮抗腫瘤作用的重要機制。然而,關于蘇木在乳腺癌中發揮抗腫瘤作用的主要活性成分仍需進一步探究。

綜上,蘇木提取液可抑制乳腺癌細胞T-47D 增殖和遷移,并促進細胞凋亡,其抗腫瘤作用是通過下調PCNA-AS1 表達實現的。