miR-34a靶向調控PI3K/AKT信號通路對牙髓炎炎癥作用的影響

符國富 韓小東 趙永興 盧敏 陳國盛( 儋州市人民醫院,海南 儋州 57700; 解放軍總醫院海南分院)

牙髓組織是人牙齒內唯一的疏松結締組織,屬于高度分化的充質組織,包裹于牙本質硬組織之中〔1〕。牙髓的構成主要是大量神經纖維及血管,牙髓對于牙齒抵御外界的刺激和傷害過程中充當重要角色〔2〕。牙髓炎發病機制及病情發展復雜,臨床癥狀主要表現為牙齒及牙齦的劇痛,物理因素、化學因素、空腔創傷導致的細菌感染等都有可能成為牙髓炎的致病因素〔3〕。此外,牙髓炎還會導致機體對牙齒的營養供給不足并且極大地阻礙了血液循環,以至于嚴重的牙髓炎能夠導致牙髓壞死,近而發生急性根尖周炎,這些都是導致患者喪失牙齒或者引發其他并發癥的危險因素〔4〕。miRNA 是機體內長度大約22 個核苷酸的微小RNA,是近來醫學學術研究的熱點〔5～7〕。其是一種不同層次上的表達調控方式,有相關研究表示,miRNA 可能參與調控痛覺神經:背根神經、脊髓背角神經等與疼痛相關基因的表達〔8〕。2001年,miR-34 首次被發現于線蟲體內,相關研究證實miR-34 是由miRNA-34a、miRNA-34b、miRNA-34c 組成,其中miR-34a 位于染色體1p36上,有學者指出,miR-34a 不但能夠對疾病疼痛發揮作用,并且可以調控蛋白水平改變機體微環境〔9〕。研究發現磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路對于人牙髓細胞的增殖和牙本質的分化有一定的影響〔10〕。本研究旨在探討miR-34a靶向調控PI3K/AKT 信號通路對牙髓炎的炎癥作用的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 4～7 周齡健康雄性大鼠(天津中醫藥大學動物科學院提供)、水合氯醛、miR-34a 抑制劑(遼寧成大生物股份有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染液(上海萊士血液制品股份有限公司)、Trizol 試劑盒、miR-34a 定量PCR 試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒(陸恒生物有限公司)、無水渦輪機、PCR儀、電泳儀(上海豐實試驗儀器有限公司)。

1.2 一般資料 選取50 只4～7 周齡健康雄性大鼠,體重150～200 g,平均體重(198.35±6.36)g。對大鼠各自分籠常規飼養7 d 后開始進行試驗,維持室溫在25～27℃,空氣相對濕度控制在50%～70%,每天保證不少于12 h 的光照,由實驗室專業人員對大鼠進行灌胃、喂養、換水等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗建模 將大鼠分成3 組,健康組10 只,模型組30 只,miR-34a 抑制組10 只。模型組、miR-34a 抑制組行牙髓暴露法制備牙髓炎模型,腹腔注射0.7 ml/100 g 的濃度為3.0% 的水合氯醛麻醉,對大鼠兩側上頜第一磨牙與第二磨牙進行酒精消毒,1/2 球鉆配合無水渦輪機開髓,穿髓點暴露,建立牙髓炎模型。建模完成后miR-34a 抑制組行頸靜脈miR-34a 抑制劑注射,劑量8 mg/kg,連續注射14 d。健康組行同劑量麻醉后不進行手術處理。

1.3.2 觀察牙髓組織病理情況 建模14 d 選取miR-34a 抑制組和健康組及造模3、7、14 d 模型組分別取10 只大鼠腹腔注射3.0% 水合氯醛麻醉,劑量為0.7 ml/100 g 的,斷頸處死(符合動物倫理學要求),取牙髓組織于緩沖液中沖洗,經甲醛固定、脫水、透明、包埋后石蠟切片,HE 染色后光鏡下觀察各組牙髓組織病理情況。

1.3.3 實時熒光定量法觀察miR-34a、PI3K mRNA和AKT mRNA 表達水平 建模14 d 抽取miR-34a抑制組和健康組及造模第3、7、14 d 模型組空腹靜脈血,Trizol 法提取血清總RNA,紫光光度儀測定OD 值,檢測RNA 純度。在35℃條件下反應25 min后75℃條件下反應15 min,RNA 逆轉錄為DNA,在上下游引物、模板、聚合酶條件下按照miR-34a 定量PCR 試劑盒的指示說明經過PCR 擴增(設定特異性內參基因和目的基因),通過熒光定量記錄反映出的miR-34a、PI3K mRNA 和AKT mRNA 的表達水平。U6 正向引物ATGTAGTCTCATCGAT-CTC、反向ATGTAGTCATCGATCGTAAT, 序列長度202 bp;miR-34a 正向引物TCCGTAGTACCTGATCAGTCT、反向GCCTCTCGAGTACGTAGTCCAG,序列長度235 bp;PI3K mRNA 正向引物CGTCTACGTGATACTGTGTGG、反向GCCAATCGTAGTCAGTCTGTACC,序列長度240 bp;AKT mRNA 正向引物 GGTACTGGTACGCCTCAATCC、反向GAATATCTACGTACGTACTAAGAA,序列長度253 bp。

1.3.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎癥因子水平 將各組牙髓組織,充分研磨后加入緩沖液靜止后離心取上清液,超低溫保存。ELISA 檢測白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α 及IL-10 水平的過程中,首先稀釋標準品液至不同的濃度梯度,分管開始測定各自吸光度值(OD),以標準品的不同濃度作為橫坐標,OD 值為縱坐標,使用軟件作圖,畫出標準曲線,根據OD 值顯示出相應蛋白的含量。

1.3.5 Western 印跡檢測PI3K/AKT 信號通路相關蛋白水平 建模14 d 用Western 印跡法檢測大鼠牙髓組織內p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達,對牙髓組織研磨后經組織裂解后電壓80 V 上樣,溴酚藍泳出分離膠。聚偏氟乙烯(PVDF)膜內行蛋白質電轉移,連續90 min 的恒定電流30 mA。PVDF 膜取出后于脫脂奶粉中封閉并震蕩1 h。結束后TNST 洗膜10 min,3 次,PVDF 經雜交、稀釋、封口后,低溫孵育過夜;TBST 洗膜10 min,3 次,加入標記二抗,震蕩溫育10 min,暗室下曝光、顯影、定影。清水沖洗后,晾干掃描,使用IPP 軟件對目的條帶進行灰度分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0 軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 各組牙髓組織病理情況 健康組牙髓組織無明顯炎癥細胞浸潤。建模3 d 大鼠牙髓組織開始發生輕度炎癥現象,大鼠穿髓點處開始出現中性粒細胞,牙髓纖維開始變性,出現漿液型炎癥反應,牙本質細胞出現錯亂,牙根髓變化不明顯,紅細胞少許散布。建模7 d 牙髓組織壞死,纖維組織少許,炎性細胞大量浸潤,牙本質紊亂,牙根髓組織明顯充血,大量紅細胞分布。建模14 d 牙冠髓已被炎性細胞完全侵染,牙本質及成纖維細胞發生凝固性壞死及形態變異,瘀血開始堵塞血管,牙根髓空泡變形完全錯亂。而miR-34a 抑制組大鼠牙髓組織僅發生輕度炎癥反應,牙根髓較健康組無明顯變化。見圖1。

圖1 各組牙髓組織病理(HE 染色,×100)

2.2 各組牙髓狀況比較 建模3、7、14 d 的牙髓根尖破損長度、根尖周膜寬及牙髓壞死率較健康組顯著上升(P＜0.05);而miR-34a 抑制組牙髓根尖破損長度、根尖周膜寬及牙髓壞死率較建模14 d 水平顯著減小(P＜0.05),其與健康組各指標狀況無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組牙髓狀況及PI3K/AKT 信號通路相關基因表達比較(±s,n=10)

表1 各組牙髓狀況及PI3K/AKT 信號通路相關基因表達比較(±s,n=10)

與健康組比較:1)P＜0.05;與miR-34a 抑制組比較:2)P＜0.05;下表同

組別根尖破損長度(μm)根尖周膜寬度(μm)牙髓壞死率(%)PI3K mRNAAKT mRNA健康組840.33±178.65233.56±38.790.00±0.002.81±0.823.41±1.07建模3 d915.67±166.581)289.64±45.221)32.15±3.281)7.10±2.251)6.89±1.861)建模7 d1 105.00±196.351)324.56±41.231)54.75±3.111)14.52±3.191)2)13.61±2.741)2)建模14 d1 472.33±177.641)2)519.57±40.821)2)89.67±3.041)2)28.23±5.381)2)32.55±6.131)2)miR-34a 抑制組870.45±188.42253.88±41.3618.87±3.014.87±1.135.04±1.29 F/P 值13.702/0.00015.889/0.00017.955/0.000116.047/0.000139.445/0.000

2.3 各組miR-34a、PI3K/AKT 信號通路相關基因及炎癥因子相對表達 建模7、14 d 血清miR-34a相對水平較健康組顯著上升(P＜0.05);建模3、7、14 d,牙髓組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 及IL-10 相對水平較健康組顯著上升(P＜0.05);miR-34a 抑制組血清miR-34a 相對水平較14 d 顯著下降(P＜0.05);牙髓組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 及IL-10 的相對水平較建模3、7、14 d 組顯著下降(P＜0.05),與健康組無統計學差異(P＞0.05)。模型組PI3K 及AKT mRNA 表達較健康組顯著上升,且隨著建模天數的增加,差異越明顯(P＜0.05);miR-34a 抑制組PI3K 及AKT mRNA 表達較建模7、14 d 組下降,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1、表2。

表2 各組炎癥因子、miR-34a 相對水平比較(±s,n=10)

表2 各組炎癥因子、miR-34a 相對水平比較(±s,n=10)

組別miR-34aTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)28.86±5.72建模3 d 組1.11±0.7858.25±14.771)2)63.45±13.851)2)60.44±15.321)2)51.33±12.361)2)建模7 d 組3.55±1.671)114.78±36.851)2)127.86±40.751)2)133.40±35.551)2)111.45±37.801)2)建模14 d 組6.88±2.351)2)199.32±55.841)2)187.66±47.331)2)201.13±48.871)2)185.34±44.321)2)miR-34a 抑制組0.99±0.4535.76±5.6637.44±7.6131.20±4.3832.56±3.97 F/P 值11.785/0.00124.351/0.00118.880/0.00115.健康組0.88±0.3220.62±2.3816.79±3.5518.37±2.46 536/0.00117.772/0.001

2.4 各組PI3K/AKT 信號通路相關蛋白的表達與健康組相比,模型組p-PI3K 及p-AKT 蛋白表達顯著上升(P＜0.05);而模型組相比,miR-34a 抑制組p-PI3K 和p-AKT 水平顯著降低,且p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達較健康組無統計學差異(P＜0.05)。見表3、圖2。

圖2 Western 印跡檢測各組PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

表3 各組PI3K/AKT 信號通路相關蛋白相對表達(±s)

表3 各組PI3K/AKT 信號通路相關蛋白相對表達(±s)

組別n PI3 K.03 p-PI3KAKTp-AKT健康組100.67±02.38±1.110.77±0.026.48±0.98模型組301.78±0.3224.65±10.521)2)0.98±0.0432.85±14.841)2)miR-34a 抑制組101.32±0.343.77±3.750.79±0.0110.24±4.11 F/P 值0.639/0.33412.586/0.0120.557/0.4429.770/0.004

3 討 論

牙髓炎的病情進展中,對于輕度炎癥牙髓組織能夠自我修復與再生,而重癥牙髓炎會造成牙髓壞死〔11〕。牙髓組織對于外部細菌及其產物刺激、機械刺激的應激反應多依賴于感染位置聚集的白細胞〔12〕。相關試驗指出,炎性細胞因子能夠在分子水平上對牙髓細胞的炎癥反應進行調節,參與牙髓炎炎癥進展的全過程,機體伴有牙髓炎病癥時,機體內IL-6、IL-8、IL-10 等細胞因子含量較健康牙髓內顯著升高〔13〕。IL-8 一般在炎癥前期產生影響,IL-8 在炎癥發生的位置募集中性粒細胞對炎癥反應起介導作用,是炎癥前期第二大細胞因子〔14〕。PI3K/AKT信號通路在細胞中有重要作用,其能夠參與調控細胞的增殖、凋亡、分化及自我更新等多個生理過程〔15〕。研究〔16〕表明,PI3K/AKT 信號通路是骨髓間充質干細胞成骨分化的關鍵調控信號通路,且其能夠有效增強牙髓細胞的增殖分化能力。PI3K/AKT信號通路中的PI3K 在一定條件下能夠被激活并活化下游關鍵蛋白AKT,進而調控相關靶蛋白,發揮生物學效應〔17〕。與此同時,近年來miRNA 在疼痛相關疾病中的作用引起學術界的廣泛關注。Brandenburger 等〔18〕在坐骨神經部分結扎模型中觀察到部分miRNA 在脊髓背角和背根神經節中均有表達,且不同疼痛指數下的表達有所不同。關祥艷等〔19〕發現敲除小鼠miR-103 可引起痛覺敏感,鞘內注射miR-105 緩解痛感有明顯作用。miR-34a 可通過調節多種細胞因子來影響腫瘤細胞增殖、細胞周期改變和腫瘤侵襲等。Weeraratne 等〔20〕研究指出miR-34a 可以通過靶向調控下游腫瘤抑制因子表達,改變腫瘤對化療的敏感性。而目前miR-34a 靶向調控PI3K/AKT 信號通路對牙髓炎炎癥產生作用這一課題值得進行試驗探究。

本試驗結果表明,建模后的大鼠牙髓產生炎癥反應。提示根尖周炎一般發生于牙髓壞死之前,是牙髓壞死的逐步演化過程。猜測其作用機制應該與細菌感染后細菌毒性產物進入到牙髓暴露的牙根管中形成持續性抗原,導致根尖周病。提示miR-34a對牙髓炎炎癥作用的調控與PI3K/AKT 信號通路存在關聯。在牙髓炎的炎癥進程中miR-34a 靶向調控PI3K/AKT 信號通路產生的作用至關重要。

本試驗發現牙髓炎發生過程中與miR-34a 和PI3K/AKT 信號通路基因蛋白相關的細胞因子級聯反應及基因水平的信號調控過程。miR-34a 在牙髓炎模型中上調自身表達靶向調控PI3K/AKT 信號通路,上調PI3K/AKT 信號通路中PI3KmRNA、AKTm-RNA 和p-PI3K 和p-AKT 蛋白的表達,促進炎癥因子的釋放加重牙髓炎的炎癥作用。而另一方面,其他相關基因和蛋白是否也參與了這一調控過程,或者如何調控及本課題在人體中是否能夠得到統一結果,本試驗未進行探究和闡釋,需待重復性實驗進一步討論。

綜上所述,miR-34a 靶向調控PI3K/AKT 信號通路的激活增大了牙髓炎炎癥反應程度,促進病情發展,提示或可通過對miR-34a 和PI3K/AKT 信號通路的抑制降低炎癥因子表達,從而控制牙髓炎的炎癥作用。