羥基紅花黃色素A對老齡大鼠膝關節骨性關節炎的干預效果及作用機制

李清瀚 王大麟 王海濤 (北華大學臨床醫學院,吉林 吉林 132000)

膝關節骨性關節炎(KOA)主要病癥是膝關節處的軟骨組織出現退行性病變及膝關節周圍出現骨質增生的現象〔1,2〕。KOA 的發病率較高,多發于中老年人,有研究顯示,近些年KOA 的發病趨勢呈現逐年上升〔3〕。目前關于KOA 的發病尚未完全闡明,關節軟骨的損傷是不可逆的,藥物或手術治療均不能值KOA 的進展,因此,對于KOA 的治療大多在于緩解炎癥反應,改善關節功能,從而延緩疾病進展〔4,5〕。羥基紅花黃色素(HSY)A 可以使過氧化氫引起的氧化脅迫狀態得到有效的改善,還能夠起到保護細胞及減輕氧化損傷的作用。具有抗炎活性〔6〕。本研究分析HSYA 對老齡KOA 的干預作用,明確HSYA 與KOA 的關系。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取18～21月齡SD 大鼠60 只,平均(18.53±1.42)月齡,體重450～520 g,平均體重(460.75±33.25)g,購自廣州賽業百沐生物科技有限公司,生產許可證號:SCXK(粵)2020-0055,使用許可證號:SYXK(粵)2020-0242,雌雄各半,SD 大鼠均飼養于標準鼠籠,明暗周期12/12 h,相對濕度45%～50%,溫度18～24℃,不間斷供給水、食物,適應性飼養1 w。

1.2 分組與建模 在60 只大鼠中隨機選取12 只作為正常組,其余大鼠均參照改良Hulth 法造模〔7〕,術前對大鼠進行腹腔注射麻醉,麻醉藥物采用10%水合氯醛(300 mg/kg),將大鼠固定成呈仰臥位,做右下膝關節內側1 cm 左右入刀,離斷摘除前后交叉韌帶、內側半月板,然后進行髕骨復位,最后進行止血包扎。為預防大鼠出現感染狀況,術后3 d 將青霉素20 萬U/d 肌注到大鼠體內。術后第5 天讓大鼠使用右下肢進行活動,每次活動時間為30 min,共干預4 w。干預4 w 后,隨機抽取造模大鼠4 只及正常組1 只,并采用脫頸法將其處死,對造模關節軟骨面進行觀察,當大鼠關節囊略有增生,關節滑液多呈淡黃色及關節軟骨表面略顯粗糙,符合早期KOA 樣改變,表示造模成功。

1.3 給藥干預 造模成功后,將手術造模成功44 只大鼠隨機分為模型組、HSYA 低劑量組、HSYA中劑量組、HSYA 高劑量組各11 只,HSYA 凍干粉購自成都康邦生物科技有限公司,將0.9%氯化鈉注射液加入HSYA 中稀釋成0.5 mg/ml 的溶液。HSYA 低劑量組給予大鼠濃度為2.5 mg/kg 的HSYA,HSYA 中劑量組給予大鼠濃度為5.0 mg/kg HSYA,HSYA 高劑量組基于大鼠濃度為10.0 mg/kg HSYA,3 組均注射到大鼠右側膝關節腔部位,均注射量為20 μl,1 次/w,連續給藥3 次,正常組及模型組每日各給予等量的生理鹽水進行干預。

1.4 病理形態學觀察 在喂養及給藥3 w 后,采用脫頸法將大鼠處死,消毒后,準確剝取大鼠的右側脛骨平臺、股骨髁中及外側軟骨組織,迅速固定在4%的多聚甲醛溶液中,在常溫的環境下固定48 h,隨后流水沖洗數小時,隨后對軟骨標本進行脫鈣處理。用生理鹽水對脫鈣后的軟骨組織進行沖洗,乙醇脫水、浸蠟,石蠟包埋后進行厚度為4 μm 切片,鋪片,蘇木素染色,流水沖洗,在此進行乙醇脫水,在采用伊紅染色,最后利用濃度為100%的酒精進行脫水處理,二甲苯透明,封片。

1.5 大鼠膝關節直徑及足趾容積測量 對大鼠膝關節及足趾容積,分別采用游標卡尺,足趾容積儀進行測量,在對其進行對比。

1.6 炎癥因子檢測 取大鼠腹主動脈血,4℃在環境下進行2 000 r/min 的離心處理,離心20 min,半徑為6 cm,并將上清液保存在-20℃冰箱內待測。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對炎癥因子的含量進行檢測,操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-13、MMP 抑制劑(TIMP)-1 檢測 應用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)進行檢測,取大鼠軟骨組織,剪碎,提取miRNA,具體操作參照試劑盒說明書,測定濃度及純度后,將其反轉錄為cDNA,RNA 反轉錄試劑盒購自TaKaRa 寶生物工程有限公司,再以cDNA 為模板,加入相關試劑及引物后進行PCR 擴增,以GAPDH為內參,引物序列:GAPDH 上游引物5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′,下游5′-TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3′,MMP-3 上游引物5′-GCAAATCCCTACTCAGAAG-3′,下游5′-TTTTCCAGTATCCTCCTCAG-3′,MMP-13 上游引物5′-TGACAGGCTCCGAGAAATG-3′,下游5′-CGTTGTATTCACCCACATCAG-3′,TIMP 上游引物5′-GCGTTATGAAATCAAGACCACCA-3′,下游5′-CGCAGTTGTCCAGCGATGAGA-3′,反應條件為:95℃3 min,變性95℃12 s,退火62℃40 s,共40 個循環,實驗結果采用2-ΔΔCt進行計算MMP-1、MMP-13 和TIMP 的相對表達量。

1.8 通路蛋白相對表達 取大鼠待測軟骨組織100 mg 按1 ∶5加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白,經電泳、轉膜后,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(1 ∶300),孵育過夜。加入二抗(1 ∶5 000),常溫孵育2 h,顯影、定影、沖洗、晾干,置于凝膠圖像成像分析系統,曝光各組蛋白條帶,拍照,計算各組蛋白條帶灰度值。

1.9 統計學處理 采用SPSS26.0 軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1 組織學觀察 正常組軟骨細胞飽滿大小均一,排列整齊,表面平整,可見雙核結構,潮線清晰完整。模型組軟骨組織表面碎裂,軟骨細胞缺失,細胞核濃縮,軟骨細胞出現壞死。HSYA 低劑量組關節軟骨表層變薄,軟骨細胞出現缺失,表面出現裂隙,可清晰的看見軟骨細胞出現壞死。HSYA 中劑量組關節軟骨輕度變薄,軟骨存在小裂隙,多個軟骨細胞聚集。HSYA 高劑量組關節軟骨變薄,軟骨存在小裂隙,表層細胞形態接近于正常。見圖1。

圖1 各組軟骨組織學觀察(HE 染色,×200)

2.2 各組膝關節直徑及足趾容積比較 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組膝關節直徑、足趾容積均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA 低、中、高劑量組膝關節直徑、足趾容積均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA中、高劑量組膝關節直徑、足趾容積均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組膝關節直徑、足趾容積均明顯降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組炎癥因子表達比較 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17水平均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 水平均明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組膝關節直徑及足趾容積、炎癥因子表達比較(±s,n=11)

表1 各組膝關節直徑及足趾容積、炎癥因子表達比較(±s,n=11)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與HSYA 低劑量組比較:3)P＜0.05;與HSYA 中劑量組比較:4)P＜0.05;表2 同

組別膝關節直徑(mm)足趾容積(ml)IL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)IL-6(μg/L)IL-17(μg/L)1±0.0515.41±3.14模型組8.16±0.221)1.66±0.151)20.04±1.121)58.77±5.221)0.67±0.091)36.84±7.551)HSYA 低劑量組8.01±0.181)2)1.62±0.131)2)18.52±1.411)2)43.52±4.741)2)0.51±0071)2)30.71±6.841)2)HSYA 中劑量組7.94±0.161)2)3)1.52±0.101)2)3)13.42±1.371)2)3) 28.84±3.521)2)3)0.39±0.081)2)3)26.72±4.741)2)3)HSYA 高劑量組7.76±0.231)2)3)4) 1.47±0.091)2)3)4) 6.72±1.121)2)3)4) 15.52±3.251)2)3)4) 0.27±0.071)2)3)4) 17.54±2.151)2)3)4)F/P 值20.220/0.0017.316/0.00144.175/0.00147.1正常組7.16±0.111.41±0.086.04±1.115.16±2.170.2 75/0.00122.230/0.00113.038/0.001

2.4 各組信號核因子(NF)-κB 通路相對表達量比較 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組核因子κB 抑制因子(IκB)α、NF-κB P65 表達均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA 低、中、高劑量組IκBα、NF-κB P65 表達均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA 中、高劑量組IκBα、NF-κB P65 表達均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組IκBα、NF-κB P65 表達均明顯降低(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組軟骨中NF-κB 通路蛋白表達

2.5 各組關節軟骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達對比 與正常組相比,模型組、HSYA 低、中、高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達均明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,HSYA 低、中、高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達均明顯降低(P＜0.05),與HSYA 低劑量組相比,HSYA 中、高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達均明顯降低(P＜0.05)。與HSYA 中劑量組相比,HSYA 高劑量組MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表達均明顯降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組關節軟骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1、信號NF-κB 通路表達對比(±s,n=11)

表2 各組關節軟骨中MMP-3、MMP-13、TIMP-1、信號NF-κB 通路表達對比(±s,n=11)

組別MMP-3MMP-13TIMP-1IκBαNF-κ B P65正常組25.42±7.1727.53±4.5216.47±4.081.00±0.011.00±0.01模型組78.24±10.211)81.61±5.721)30.62±4.151)2.53±0.331)2.24±0.391)HSYA 低劑量組61.58±6.571)2)66.67±5.141)2)27.52±5.331)2)2.08±0.241)2)2.02±0.311)2)HSYA 中劑量組41.74±8.831)2)3)47.78±5.881)2)3)23.57±4.581)2)3)1.82±0.171)2)3)1.68±0.251)2)3)HSYA 高劑量組33.14±7.251)2)3)4)35.74±5.691)2)3)4)19.57±4.691)2)3)4)1.34±0.131)2)3)4)1.24±0.151)2)3)4)F/P 值21.060/0.00136.900/0.00112.096/0.00123.055/0.00115.810/0.001

3 討 論

關節軟骨作為一種特殊的結締組織,其軟骨細胞轉化率較低,因此軟骨損傷后自我修復能力較差。同時,軟骨細胞更新及代謝過程極為復雜,由多種細胞因子參與完成。軟骨細胞凋亡、細胞外基質降解是導致KOA 軟骨降低的主要因素〔8,9〕。中醫學認為KOA 屬“骨痹”范疇,其發病與肝、脾、腎虧損及風、寒、濕、瘀血客于局部密切相關〔10〕。

HSYA 臨床在心血管疾病的治療中起重要作用,HSYA 具有抗感染作用〔11〕。有相關研究表明〔12〕,HSYA 能夠使LPS 得到有效抑制,進而使TNF-α、IL-1β、IL-6 及其他炎癥因子的表達出現異常升高的狀態。HSYA 還可以使髓過氧化物酶及一氧化氮合酶的活性得到抑制,進而緩解了腦組織中的浸潤〔13,14〕。有研究顯示,當關節軟骨細胞出現的凋亡及軟骨祖細胞出現遷移障礙時,其主要原因是因為關節軟骨組織中分泌的MMP-1、MMP-13 表達呈現異常升高的狀態,進而導致關節軟骨無法再生。本研究進一步發現,HSYA 可使KOA 大鼠體內MMP-1、MMP-13 表達降低,從而延緩疾病進程。

KOA 發病與炎癥因子之間存在著密切的相關性,關節軟骨合成蛋白多糖組分、蛋白糖胺聚糖及Ⅱ型膠原蛋白均會因TNF-α 與IL-6 協同而出現不同程度的影響,協同IL-1β 在骨關節炎的發生過程中起著決定性的作用,IL-1β 對關節軟細胞代謝及細胞外基質有著顯著影響〔15,16〕。促進MMPs 的分泌來破壞關節軟骨成分。本研究顯示,IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 在KOA 模型大鼠體內呈現高表達,HSYA 可減輕大鼠體內炎癥因子表達,修復關節軟骨損傷,抑制KOA 的發生進展。

NF-κB 信號通路是體內重要的炎癥通路,其與機體內的炎癥產生和激活均有不同程度的相關性。在KOA 炎癥發生過程中NF-κB 是關鍵的轉錄分子,對KOA 的各個階段均存在不同程度的影響。NF-κB 可以在生理狀態下和IκB 進行結合,以復合物的狀態存在于機體內〔17,18〕。NF-κB 活化的敏感標志是IκB 蛋白的表達,NF-κB P65、IκBα 分別為NF-κB、IκB 蛋白家族成員,二者可以使NF-κB 信號通路在膝關節骨中得到有效的抑制作用〔19,20〕。本研究結果表明NF-κB 通路激活,經HSYA 干預,NFκB P65、IκBα 在KOA 表達下調,表明HSYA 可抑制NF-κB P65、IκBα 活性,從而改善KOA 臨床癥狀,減輕炎性反應。

雖然本文認為HSYA 具有改善KOA 的作用,其作用機制可能與炎癥反應及NF-κB 通路有關,但臨床并未有其他研究分析其關系,因此本研究所得結果還需后續研究驗證,為KOA 的研究提供新方向。