利拉魯肽通過抑制核因子κB對糖尿病腎病小鼠的治療作用

張靜 樊文星 楊玥娜 蘇鳳 Mali Niroj( 昆明醫科大學第一附屬醫院腎臟內科,云南 昆明 65003; 昆明醫科大學)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)常見的、嚴重的微血管并發癥,是世界范圍內終末期腎臟病(ESRD)的最常見病因之一〔1〕。中國流行病學調查研究數據表明,DN 已成為我國住院慢性腎臟病(CKD)患者和成人終末期腎病的首要病因〔2〕。DN發病與炎癥反應及細胞因子的分泌異常關系密切,核因子(NF)-κB 是一種快反應轉錄因子,可調節多種基因表達,參與炎癥免疫反應,在DN 發病中起重要作用〔3〕。胰島血糖素樣肽(GLP)-1 受體激動劑是近年來新型的降糖藥物,其主要通過與細胞膜表面的GLP-1 受體結合,激活下游的信號通路,發揮生物學作用,其受體廣泛分布于腎臟、心臟、血管內皮細胞、腸道、中樞及外周神經系統等〔3,4〕。利拉魯肽是臨床上較常用的一種長效GLP-1 受體激動劑,與天然的人GLP-1 具有97%的同源性〔4〕。利拉魯肽能夠減輕氧化應激與炎癥反應,減少DM 大鼠尿蛋白的含量,延緩DN 的進展,同時能抑制DM 大鼠心肌細胞凋亡,并對血壓、血脂產生有益影響,表明該受體的多向表達與GLP-1 受體激動劑的多器官保護作用可能有關〔3,5〕,但其具體分子機制尚不明確。本研究旨在證實利拉魯肽對DN 小鼠的治療作用,并探討其可能的治療機制。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑、主要儀器 利拉魯肽注射液(丹麥諾和諾德公司),鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司),SYBR Green Master(美國羅氏公司),RNA 提取試劑盒(美國Omega 公司)。抗體包括β-actin 鼠一抗、NF-κB 鼠一抗、山羊抗鼠二抗從北京Abmaking 生物技術有限公司獲得,Taq 酶和逆轉錄試劑盒(日本Takara 公司)。聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國ABI 公司),微核酸檢測儀(中國北京原平昊生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物和飼料 30 只雄性6 周齡C57BL/6小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司),體重18～23 g。小鼠飼料(上海基因生物科技有限公司),標準飼料:蛋白質18%,脂肪4%,碳水化合物49%。高脂飼料:蛋白質18%,脂肪35%,碳水化合物18%。實驗程序均經昆明醫科大學倫理委員會批準。

1.3 DN 小鼠模型的建立與實驗分組 30 只小鼠適應性喂養1 w 后隨機分為正常對照組(對照組),DN 組和利拉魯肽(DN+利拉魯肽)組,每組10 只。DN 組和利拉魯肽組予以50 mg/kg 劑量隔天一次腹腔注射由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制STZ 溶液3 次,并同時喂養高脂飲食以建立DN 模型。對照組予注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液并標準飼料喂養。4 w 后連續3 d 測隨機血糖,小鼠的血糖水平≥2 g/L,腎功能和尿蛋白指標顯著高于對照組,DN 模型建立成功。利拉魯肽組每日腹腔注射200 μg/kg利拉魯肽,DN 組及對照組腹腔注射等量的生理鹽水。3 組連續干預6 w,在此期間喂養標準飼料。

1.4 標本采集及生化指標測定 小鼠禁食12 h,代謝籠中收集尿液標本。自動生化儀檢測尿中的微量白蛋白尿(MAU)、N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)。稱重小鼠,麻醉小鼠眼瞼取血后用自動生化分析儀分析血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及腎功能指標包括尿素(UR)、肌酐(CR)和尿酸(UA)。頸椎脫臼法處死小鼠留取腎臟標本。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測腎組織中NF-κB 信使核糖核酸(mRNA)的表達 RNA 提取試劑盒提取腎組織總RNA,提取2 μg RNA,以寡核苷酸(dT)作為通用引物:NF-κB 基因的上游引物:5′-ACCGCCGTGCAGGATGAGA-3′,下游:5′-ACGGCCAAGTGCAGAGGTGTC-3′,逆轉錄反應合成cDNA。實時PCR 體系:1 μl cDNA,1 μl 引物,10 μl SYBR Green 熒光染料和7 μl 無菌蒸餾水。反應過程:50℃加熱2 min,95℃預變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,擴增40 次,測定NF-κB mRNA 的相對表達水平。

1.6 Western 印跡檢測腎組織中NF-κB 蛋白的表達 腎組織中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)+蔗糖溶液研磨離心,提取總蛋白,微核酸蛋白檢測儀測蛋白質濃度。取蛋白質溶液于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉膜,5%牛血清白蛋白(BSA)緩沖液(TBST)封閉膜2 h。加入NF-κB 抗體4℃孵育過夜,加入二抗,室溫孵育2 h,加入辣根過氧化物酶顯色。β-肌動蛋白作為內參,成像系統檢測記錄實驗結果,應用ImageJ 軟件計算光密度,進行組間比較。

1.7 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 3組血液生化指標的比較 DN 組GLU、TC、TG、LDL 及體重均顯著高于對照組(P＜0.01,P＜0.05),HDL 顯著低于對照組(P＜0.01);利拉魯肽組GLU、TC、TG、LDL 及體重顯著低于DN 組,而HDL 顯著高于DN 組(P＜0.05),見表1。

表1 3 組血液生化指標的比較(±s,n=10)

與對照組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.05;與DN 組比較:3)P＜0.05

組別GLU(g/L)TC(mg/L)TG(mg/L)HDL(mg/L)LDL(mg/L)體重(g)27.28117.54±6.7331.12±1.71 DN 組3.65±0.482)1 558.25±7.191)1 031.67±78.152)445.17±52.232)159.12±8.932)35.11±1.942)利拉魯肽組3.03±0.253)786.44±9.233)862.21±80.163)658.05±64.743)112.14±5.073)33.73±1.803)對照組1.16±0.07825.34±6.41647.32±15.68563.32±

2.2 3組尿液中微蛋白含量比較 DN 組MAU 和NAG 顯著高于對照組(P＜0.01);利拉魯肽組MAU和NAG 顯著低于DN 組(P＜0.05),見表2。

2.3 3組血液中UR、CR 和UA 含量比較 DN 組UR、CR 和UA 顯著高于對照組(P＜0.01);利拉魯肽組UR、CR 和UA 顯著低于DN 組(P＜0.05),見表2。

2.4 3組腎組織NF-κB mRNA 和蛋白表達比較DN 組NF-κB mRNA 水平和蛋白顯著高于對照組(P＜0.01)。與DN 組相比,利拉魯肽組NF-κB mRNA 和蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見表2。

表2 3 組尿液中微蛋白含量、血液中UR、CR 和UA 含量及腎組織NF-κB mRNA 蛋白相對表達的比較(±s,n=10)

表2 3 組尿液中微蛋白含量、血液中UR、CR 和UA 含量及腎組織NF-κB mRNA 蛋白相對表達的比較(±s,n=10)

與對照組比較:1)P＜0.01;與DN 組比較:2)P＜0.05

組別MAU/CR(mg/μmol)NAG/CR(U/μmol)UR(mmol/L)CR(μmol/L)UA(μmol/L)NF-κB mRNANF-κB 蛋白對照組0.85±0.184.62±1.549.23±0.7131.67±1.2128 1.16±32.6720.42±2.713.04±1.21 DN 組3.37±1.011)9.66±3.011)17.45±1.781)39.85±0.931)376.35±8.711)52.94±6.321)7.71±1.941)利拉魯肽組1.66±0.772)8.01±1.992)11.92±1.132)34.46±1.622) 324.15±19.062) 36.71±4.132)5.19±1.422)

3 討 論

在1 型或2 型DM 患者中有25%～40%發生DN,DN 患者有發展為ESRD 的較高風險,同時有較高的心血管疾病發病率及死亡率〔6〕,強調了早期預防、識別和及時治療的重要性。

在T2DM 患者中觀察到,餐后高脂血癥是DM性血脂異常的重要特征〔7〕,這是乳糜微粒產量增加和乳糜微粒清除率降低的結果,乳糜微粒產生的增加與腸道載脂蛋白(Apo)B48 分泌速率的增加和腸內微粒體TG 轉運蛋白(MTP)表達的增加有關〔8〕。研究〔8〕發現:利拉魯肽1.2 mg/d 治療T2DM 患者6 個月后,體重、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素抵抗(HOMA-IR)、TG、TC 和ApoB顯著降低,LDL 略有下降;動物實驗:利拉魯肽治療1 w 后,顯著降低小鼠血漿TG 負荷;其體外實驗表明:利拉魯肽可顯著降低腸組織中乳糜微粒合成相關基因ApoB48,二脂酰甘油酰基轉移酶(DGAT)1和MTP 的表達。總之,利拉魯肽可顯著降低T2DM和典型DM 血脂異常,其機制可能是多方面的,腸組織中GLP-1 受體的存在強化了利拉魯肽可能對腸道的直接作用〔8,9〕。

一項納入9 340 例T2DM 伴心血管疾病(CVD)高風險患者的多中心、國際、隨機、雙盲、安慰劑對照的3B 期臨床試驗LEADER〔10,11〕,其隨訪中位數時間3.8年,該實驗數據的二次分析研究結果顯示利拉魯肽致復合腎結局風險低于安慰劑組,其中主要歸因于新發持續大量白蛋白尿發生率減少,其風險減少達26%,表明利拉魯肽可延緩DN 的發生和發展。

T2DM 是一種慢性低度炎癥性疾病,T2DM 及其并發癥的發生、發展涉及多種炎癥因子〔12〕。既往研究中已發現利拉魯肽可抑制炎癥因子白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)的表達〔3〕。NF-κB 有多向轉錄調節作用。正常細胞中,NF-κB 與其抑制蛋白I-κB 家族的成員結合,當細胞受到刺激,I-κB發生磷酸化,在蛋白水解酶作用下發生降解,從而使NF-κB 活化并進入細胞核中,與相應靶序列結合,調控多種基因的表達,包括單核細胞趨化因子(MCP)-1、IL-6、TNF-α、細胞間黏附分子(ICAM)-1、轉化生長因子(TGF)-β1、IL-1β 等基因,從而在炎癥反應中起重要作用〔3,13,14〕。本研究提示,利拉魯肽可通過抑制炎癥因子來治療DN 小鼠。研究表明,利拉魯肽對DM 大鼠的腎臟保護作用,并不依賴于血糖、體重的降低,它可通過與腎組織中GLP-1 受體結合,抑制腎組織局部炎性因子的分泌,抑制炎癥反應過程〔3〕。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是NF-κB 較重要的上游激酶,在高糖狀態下可被上游信號、細胞因子及理化因素所激活,使NF-κB 活化進入細胞核,促進炎性基因的表達與炎性因子的分泌,從而加重DN, 與 DN 密切相關的 MAPK 有 p38MAPK、ERKl/2、JNK〔3〕,其具體的分子機制還有待進一步研究。本實驗研究炎癥因子相對單一,與DN 相關的NF-κB 信號通路是下一個研究方向。