基于AC/cAMP通路探討清竇靈合劑對鼻竇炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白表達的影響

張田 喻國凍 顧平 唐強 金瑩 (貴州醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉科,貴州 貴陽 550004)

鼻竇炎是從鼻竇黏膜發展的炎性的耳鼻喉科常見疾病,臨床表現為鼻塞,流膿涕,頭痛,眩暈,嗅覺障礙,記憶力下降等,伴有急性上呼吸道感染,在兒童及青少年中發病率極高,經常反復發作,甚至久治不愈〔1〕。目前關于該病的發病機制尚未完全闡明,因此尚無根治性治療手段。我國中醫藥治療手段在控制鼻竇炎癥狀方面效果顯著。許多中成藥如鼻竇炎口服液、鼻淵合劑、宣肺通竅顆粒等在臨床上顯示了良好的療效〔2〕。清竇靈合劑主要由細辛、辛夷、蒼耳子、黃芪、白術、白芷、防風、黃芩、川芎、薄荷、金銀花等中藥組成。李良波等〔3〕臨床研究表明使用清竇靈合劑治療兒童鼻-鼻竇炎效果良好,并且復發率較低,沒有不良反應,但其中機制尚無報道。武楠等〔4〕研究報道甲基丁香酚(中藥細辛的主要活性成分)通過調控水通道蛋白(AQP)5 的表達改善過敏性鼻炎大鼠的癥狀。研究表明〔5〕AQP 表達參與調控細胞內外的水平衡,直接維系細胞膜的通透性。研究表明〔6〕腺苷酸環化酶(AC)/環磷酸腺苷(cAMP) 通路是機體內介導水液代謝,細胞膜通透性的關鍵通路。但是未有AC/cAMP 通路對鼻黏膜上AQP 表達影響的報道。本研究通過建立鼻竇炎大鼠模型,從AC/cAMP 通路對鼻黏膜上AQP 蛋白表達的影響角度出發,探討清竇靈合劑對鼻竇炎的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 10～12 周齡,SPF 級,雄性,SD 大鼠,體重200～220 g,共計60 只,從貴州省中觀生物技術有限公司采購,許可證號:SCXK(黔)2018-0004。

1.2 主要試劑和儀器 清竇靈合劑(貴州醫科大學附屬醫院制劑室生產,批號為: H20160467);青霉素V 鉀片(0.236 g×30 片,西南藥業股份有限公司,批號為:國藥準字H20067446)。免疫組化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司,蛋白濃度測定試劑盒購自南京建成生物有限公司,磷酸化蛋白激酶(p-PK)A、磷酸化環磷酸腺苷及應單元結合蛋白(p-CREB)抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒采購自美國Cell Signaling 公司, Western 印跡試劑盒購自美國BIORAD 公司。倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);凝膠成像儀(美國Beckma 公司);小型臺式離心機(北京六一公司);小微動物全自動生化儀(美國BIO-RAD 公司);生物超凈工作臺(上海醫療器械制造廠)。

1.3 模型構建和分組處理 實驗大鼠在醫院的飼養房標準條件下適應性生活1 w 后開始實驗。將大鼠隨機分為正常組、模型組、實驗組、對照組,每組15 只;參照文獻〔7〕建立急性鼻竇炎大鼠模型:將大鼠全身麻醉后,使用2.0 ml(20 mg/ml)利多卡因聯合0.012 5 mg 腎上腺素,在鼻背下浸潤麻醉,同時在大鼠面中線上中1/3 交界處以45°做切口,將含有0.1 ml(1×109U/L)金黃色葡萄球菌的明膠海綿塞入切口,消毒后縫合切口。造模成功標準:以大鼠術后3 d 不喜運動,飲食量日益減少,術后第4 天大鼠出現搔鼻動作,稍見噴嚏現象,5 d 后較正常大鼠運動明顯減少,鼻腔內出現清涕,鼻潛艇潮紅,出現搔鼻、噴嚏等癥狀,視為造模成功〔7〕。實驗組和對照組每日分別以10 ml(20 mg/ml)清竇靈合劑和青霉素V 鉀灌胃給藥,正常組和模型組每日以等劑量生理鹽水進行灌胃處理,1 次/d,連續給藥7 d。

1.4 大鼠鼻部癥狀評分 連續給藥7 d 后,對大鼠鼻部癥狀進行評分,評分標準如下〔8〕:30 min 內搔鼻(1～4 次)或30 min 內噴嚏(1～4 個)或鼻腔內有少量流涕或鼻腔充血,輕度癥狀計為1 分;30 min內搔鼻(5～9 次)或噴嚏(5～9 個)或鼻腔內有較多流涕或鼻腔紅腫,中度癥狀計為2 分;30 min 內搔鼻(≥10 次)或30 min 內噴嚏(≥10 個)或鼻腔內附著分泌物或鼻腔紅腫出血,重度癥狀計為3 分。

1.5 收集血清標本及生化檢測其血清標本中的白細胞計數 在連續給藥7 d 后,經尾靜脈收集各組靜脈血,離心后獲得血清,生化檢測自動儀測定。

1.6 ELISA 檢測血清中AC、cAMP 水平 嚴格按試劑盒要求進行操作,使用多功能酶標儀進行分析。

1.7 HE 染色觀察鼻黏膜組織的組織病理學改變留取血清后,處死大鼠,在顯微鏡下佩戴無菌手套,收集鼻黏膜組織,并進行液氮封存;取出10%鼻黏膜組織,以多聚甲醛固定,常規切片后HE 染色,顯微鏡下觀察鼻黏膜病理改變。參照文獻〔9〕采用的評分方法,對大鼠鼻黏膜損傷程度進行評價,評分標準為:0 分:無損傷,無病變;1 分:輕度損傷,鼻黏膜上皮輕度水腫,稍見缺損;2 分:中度損傷,黏膜充血水腫較重,部分纖毛彎曲,纖毛排列凌亂,較多的炎性細胞浸潤;3 分:重度損傷,黏膜上皮缺損嚴重,壞死嚴重,出血點較多,纖毛倒伏嚴重,炎性細胞大量浸潤。

1.8 電鏡觀察鼻黏膜組織的超微結構改變 從冰箱中取出10%各組大鼠的鼻黏膜組織,分別制成0.3 cm×0.5 cm 大小的超薄組織切片:采用2.5%戊二醛固定8 h,生理鹽水清洗3 次,梯度濃度乙醇脫水,維持-20℃冷凍干燥過夜,掃描和透射電鏡下觀察鼻黏膜組織超微病理結構改變

1.9 免疫組化檢測鼻黏膜組織AQP1 和AQP5 的水平 從冰箱中取出20%大鼠肝組織,常規固定,脫水,浸蠟,包埋,切片,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,雞蛋清于37℃下封閉,加入一抗(1 ∶100),4℃孵育過夜,次日加入二抗(1 ∶200),PBS 沖洗后,蘇木素復染,封片。顯微鏡下觀察結果。Image Pro Plus8.0 軟件進行圖像統計分析。

1.10 Western 印跡檢測鼻黏膜組織中p-PKA、p-CREB 的表達 從冰箱中取出10%大鼠肝組織,裂解,離心(13 000 r/min,4 ℃,10 min),留取上清,測定濃度后,電泳,轉膜,雞蛋清封閉,滴加一抗(1 ∶100),4℃孵育過夜,加入二抗(1 ∶100),PBS 沖洗,顯色,凝膠成像儀下讀取各條帶的灰度值。

1.11 統計學方法 采用SPSS16.0 軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 各組鼻部癥狀的評分及血清中白細胞計數比較 與正常組相比,模型組鼻部癥狀評分和白細胞計數明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,實驗組、對照組鼻部癥狀評分和白細胞計數明顯降低(P＜0.05),實驗組和對照組差異無統計學意義(P＞0.05),見表1。

2.2 各組血清中AC、cAMP 的水平比較 與正常組相比,模型組血清中AC、cAMP 的水平明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,實驗組、對照組血清中AC、cAMP 水平明顯降低(P＜0.05),實驗組和對照組差異無統計學意義(P＞0.05),見表1。

2.3 各組鼻黏膜組織病理改變 正常組鼻黏膜組織結構完整,纖毛上皮連續,細胞排列整齊,未見水腫,充血,缺損,炎性浸潤;與正常組相比,模型組呈現典型的炎性改變,鼻黏膜上皮充血,腫脹明顯,細胞排列紊亂,大量炎性因子浸潤,鼻黏膜損傷病理評分明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,實驗組和對照組鼻黏膜損傷明顯緩解,上皮細胞稍見腫脹,充血點明顯減少,稍見缺損,炎性細胞浸潤數量明顯減少,大部分黏膜趨于正常,鼻黏膜損傷病理評分明顯下降(P＜0.05)。實驗組和對照組差異無統計學意義(P＞0.05),見表1。

2.4 電鏡觀察各組鼻黏膜組織的超微結構改變正常組鼻黏膜結構正常,黏膜纖毛密集排列,且整齊均勻,擺動規律,數量豐富,纖毛直徑及纖毛長度均一,未見異常。模型組鼻黏膜纖毛或缺失,或排列散亂,纖毛頂端黏連成簇,擺動無規則,中央微管融合或缺失嚴重,纖毛膜缺損嚴重,較多纖毛出現脫落現象。實驗組和對照組鼻黏膜纖毛脫落明顯減輕,纖毛膜較為完整,中央微管結構清晰,趨于完整,偶見粘連,見圖1。

圖1 透射電鏡觀察各組鼻黏膜超微結構改變(× 12 000)

2.5 免疫組化檢測各組鼻黏膜組織中AQP1 和AQP5 的表達 與正常組相比,模型組鼻黏膜組織中AQP1 表達明顯增強,AQP5 表達明顯下降(P＜0.05);與模型組相比,實驗組和對照組鼻黏膜組織中AQP1 表達明顯下降,AQP5 的表達明顯增強(P＜0.05),實驗組和對照組差異無統計學意義(P＞0.05),見表1、圖2。

表1 各組鼻部癥狀評分及血清中白細胞計數、AC、cAMP、鼻黏膜損傷評分及AQP1、AQP5 表達的免疫熒光強度相對值(±s,n=15)

表1 各組鼻部癥狀評分及血清中白細胞計數、AC、cAMP、鼻黏膜損傷評分及AQP1、AQP5 表達的免疫熒光強度相對值(±s,n=15)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;表2 同

組別鼻部癥狀評分(分)白細胞計數(×105 U/L)AC(μg/L)cAMP(μg/L)鼻黏膜損傷評分(分)AQP1AQP5正常組1.83±0.624.02±0.5530.51±1.243.64±0.830.22±0.17100.04±1.1199.36±1.25模型組7.85±2.961)8.69±1.071)53.57±2.681)22.67±2.071)2.53±0.341)623.65±25.361) 19.95±2.161)實驗組6.24±1.632)6.28±0.862)42.08±1.652)12.53±2.282)1.97±0.212)245.59±18.622) 64.38±5.642)對照組6.27±1.592)6.31±0.772)42.15±1.592)12.61±2.192)1.99±0.182)247.07±16.252) 63.53±5.722)

圖2 免疫組化檢測各組鼻黏膜組織中AQP1、AQP5 的表達(× 400)

2.6 Western 印跡檢測各組鼻黏膜組織中p-PKA、p-CREB 的表達 與正常組相比,模型組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 表達明顯升高(P＜0.05);和模型組相比,實驗組和對照組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 表達明顯降低(P＜0.05)。實驗組和對照組蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05),見圖3、表2。

表2 各組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 的相對表達(±s,n=15)

表2 各組鼻黏膜組織p-PKA、p-CREB 的相對表達(±s,n=15)

組別AQP1AQP5正常組0.92±0.091.00±0.05模型組7.75±0.271)4.59±0.351)實驗組2.26±0.372)2.24±0.212)對照組2.32±0.282)2.28±0.162)

圖3 Western 印跡法檢測各組鼻黏膜組織中p-PKA、p-CREB 的表達

3 討 論

鼻竇炎是累及上頜竇、篩竇、額竇和蝶竇等部位炎性疾病,屬于常見耳鼻喉科疾病,易發于各種人群。臨床上以鼻塞,頭痛,流膿涕為主要癥狀。如果不能及時控制癥狀,易引發中耳炎、上頜骨髓炎、腦膜炎等重癥并發癥。

鼻竇炎在中醫上屬于“鼻淵”范疇,在針對鼻竇炎的治療方面,中醫藥從辯證角度出發,針對患者進行個體化治療,多種治療手段并行,并且其副作用小,療效穩定,展示了獨特的優勢〔10,11〕。潘慶春等〔12〕研究證實采用溫針灸聯合通竅鼻炎方治療慢性鼻竇炎后,能明顯改善患者生活質量,降低鼻部炎性反應,提高臨床療效。姚期等〔13〕研究表明健脾化濁通竅湯針對難治性慢性-鼻-鼻竇炎具有良好的臨床治療效果。清竇靈合劑是在中醫思想指導下由細辛、辛夷等10 余味中藥組成的傳統方劑。李良波等〔14〕通過臨床研究報道清竇靈合劑在促進鼻黏膜纖毛功能早期恢復,緩解患者癥狀,減輕患者鼻腔上皮水腫,減少肉芽形成方面療效顯著。

研究表明〔15〕AQP 是一類細胞膜上負責水的分泌與吸收的進化高度保守的蛋白分子,是水分子進出細胞的主要通道,是維系細胞內外水平衡的關鍵因子。研究顯示〔16〕AQP1,AQP5 等在鼻腔黏膜中的表達與鼻腔的分泌行為關系密切。黎橋等〔17〕研究證實下調AQP1,AQP5 的表達能明顯緩解變應性大鼠的流膿涕,撓鼻及噴嚏等癥狀。AC/cAMP 通路是外界刺激因子與細胞內信號分子在細胞膜表面進行轉換的關鍵通路〔18〕。研究表明〔19〕在應激條件下,三磷酸腺苷在AC 的作用下生成第二信使cAMP,cAMP 促使PKA 磷酸化。PKA 活化后,一方面p-PKA 可直接作用于AQP 的氨基酸序列而調節AQP表達,另一方面〔20〕p-PKA 進入胞核,激活CREB,使CREB 發生磷酸化,將信號入核,影響相關基因以及轉錄子的表達,調控AQP 的表達。Chen 等〔21〕研究證實抑制AC/cAMP 通路能明顯抑制AQP 表達,改善膽固醇結石小鼠膽細胞的細胞膜通透性。Chang等〔22〕研究表明抑制人鼻上皮細胞上的AC/cAMP 的表達,能明顯上調AQP5 表達,緩解人鼻上皮細胞的水腫狀況。清竇靈合劑的治療作用可能與抑制AC/cAMP 通路,調控AQP1,AQP5 表達有關。