黃芪多糖通過(guò)破壞組蛋白去乙酰化酶7穩(wěn)定性抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)

王慧靜 羅德紅 瞿銳 胡小池(遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院) 乳腺甲狀腺外科,貴州 遵義 563000; 腫瘤內(nèi)科)

婦女中乳腺癌是被診斷出最多的癌癥,也是導(dǎo)致婦女死亡的第二大原因〔1〕。據(jù)美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),每8 個(gè)女性當(dāng)中就可能有一個(gè)患有乳腺癌〔1,2〕。在我國(guó),乳腺癌發(fā)生率約17.1%,占女性腫瘤第一位,每年約20 萬(wàn)女性被診斷為乳腺癌,且發(fā)病率逐年上升〔3〕。中醫(yī)藥因具有整體調(diào)節(jié)及毒副作用小等特點(diǎn),臨床上治療各類(lèi)惡性腫瘤療效顯著〔4〕。傳統(tǒng)中藥黃芪具有扶正抑瘤的作用,其抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),其重要活性成分為黃芪多糖(APS)〔5〕。APS 作為黃芪主要有效成分之一,除抗腫瘤作用外,還有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、降血糖等多種作用,具有良好的應(yīng)用前景,因能夠直接、間接殺傷腫瘤或協(xié)同化療發(fā)揮多重抗腫瘤活性,并且具有安全性,因而在腫瘤領(lǐng)域備受關(guān)注〔6〕。有學(xué)者認(rèn)為,APS 可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,并能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡〔7〕。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)7 是控制不同細(xì)胞命運(yùn)的多效轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器〔8〕。人類(lèi)乳腺上皮細(xì)胞中HDAC7 通過(guò)維持一個(gè)熟練的微環(huán)境,維持細(xì)胞增殖并促進(jìn)干細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)量〔9〕。特別是,HDAC7 抑制一系列細(xì)胞因子和其他環(huán)境因子,包括胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的元素,胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)6 和7〔8〕。研究表明〔10〕HDAC7 在乳腺癌中高表達(dá),APS 可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,APS 和HDAC7 的調(diào)控機(jī)制首次被發(fā)現(xiàn)。本研究探討APS 誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株乳腺癌細(xì)胞MCF-7(本實(shí)驗(yàn)室留存)。

1.2 藥物與主要試劑 APS(賽諾制藥有限公司,天津);CCK-8(Sigma 公司,美國(guó));二甲基亞砜(DMSO)(Amresco 公司,美國(guó));二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(鼎國(guó)生物有限公司,北京);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,上海);改良Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基(Thermo Fisher 公司,美國(guó));10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素(Gibco 公司,美國(guó));胰酶(Thermo Fisher 公司,美國(guó));聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通用支原體檢測(cè)試劑盒(Manassas 公司,美國(guó));碘化丙啶(Sigma 公司,美國(guó))。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 取乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),并于(37℃、5% CO2)培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞密度約80%時(shí),經(jīng)胰酶消化后,接種于6 cm 的培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng),次日分別加入相應(yīng)濃度的APS。將MCF-7 細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Control 組)和不同濃度的APS 組(0.75、1.50、3.00 mg/ml APS組)。將si-NC、si-HDAC7 轉(zhuǎn)染至MCF-7 細(xì)胞,作為si-NC 組、si-HDAC7 組;將pcDNA-NC、pcDNA-HDAC7轉(zhuǎn)染至MCF-7 細(xì)胞,再用APS(1.50 mg/ml)處理,作為APS+pcDNA-NC 組、APS+pcDNA-HDAC7 組。

1.4 CCK-8 檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞存活率〔5〕取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞MCF-7,將各組MCF-7 細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔接種于96 孔板中,每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔,向每孔中加入200 μl 細(xì)胞懸液,待細(xì)胞貼壁后加入APS 進(jìn)行處理,與細(xì)胞分別共培養(yǎng)24、48、72 h 后,檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)束后每孔加入20 μl 的CCK-8試劑,輕輕搖動(dòng),置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,之后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm 處的吸光度值,取5 孔吸光度值的平均值。將吸光度值換算成細(xì)胞存活率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 mRNA 表達(dá)〔3〕使用Tri-Reagent 對(duì)MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行裂解,提取出總的RNA。用100 U 的M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)1.0 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR 綠色技術(shù)進(jìn)行qRT-PCR。數(shù)據(jù)以HPRT 為標(biāo)準(zhǔn),采用比較閾值循環(huán)進(jìn)行分析。HDAC7 上游引物5′-TGCTCTTGTCCTTGTGGAGA-3′,下游5′-CCACCACCTCTTCCTAGCAG-3′;β-actin 上游引物5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3′,下游5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′。

1.6 Western 印跡檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 蛋白的表達(dá)〔1〕將MCF-7 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48 h,然后去掉舊培養(yǎng)液,用RIPA 裂解緩沖液從MCF-7 細(xì)胞中提取收集各組中的總蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量,將樣本煮沸約5 min,之后進(jìn)行冷卻,離心后取上清進(jìn)行電泳,通過(guò)SDS-PAGE 進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,轉(zhuǎn)膜后TBST 漂洗2 次,用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1 h,加入相應(yīng)一抗(1 ∶1 000 稀釋),4℃冰箱中孵育過(guò)夜。再用TBST 進(jìn)行2 次洗膜后,使用標(biāo)記的二抗(1 ∶200 稀釋)進(jìn)行孵育1 h,緊接著進(jìn)行3 次洗膜后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行曝光,掃膜儀成像。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞的周期阻滯情況〔3〕使用乙醇(O/N)固定MCF-7 細(xì)胞,用RN 酶A 進(jìn)行處理,用10 μg 碘化丙啶進(jìn)行染色。為了進(jìn)行S 相分析,使用50 μmol/L 的溴脫氧尿苷培養(yǎng)細(xì)胞3 h。固定后,對(duì)鹽酸處理覆蓋物,并進(jìn)行免疫熒光處理。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組MCF-7 細(xì)胞的周期阻滯率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 APS 對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 增殖的影響 APS能夠抑制MCF-7 細(xì)胞增殖,且與劑量呈現(xiàn)依賴性,APS 分別作用24、48、72 h 后,MCF-7 細(xì)胞存活率隨著藥物濃度增加而顯著降低(P＜0.05),1.50、3.00 mg/ml APS 之間無(wú)明顯差異,后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度選用1.50 mg/ml APS。見(jiàn)表1。

2.2 APS 可顯著抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中HDAC7的表達(dá) qRT-PCR 結(jié)果,不同濃度APS 能夠顯著降低MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 mRNA 表達(dá)水平,且HDAC7 mRNA 表達(dá)水平隨著藥物濃度增加而顯著降低(P＜0.05);Western 印跡結(jié)果可知,不同濃度APS 能夠顯著降低MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 蛋白表達(dá)水平,且HDAC7 蛋白表達(dá)水平隨著藥物濃度增加而顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同濃度對(duì)APS 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光值及MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響(±s,n=5)

表1 不同濃度對(duì)APS 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光值及MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響(±s,n=5)

與0.00 mg/ml APS 組比較:1)P＜0.05;與0.75 mg/ml APS 組比較:2)P＜0.05

蛋白0.00 mg/ml APS 組0.26±0.040.40±0.050.62±0.071.13±0.161.0組別吸光值0 h24 h48 h72 hHDAC7 mRNAHDAC7 0±0.090.86±0.11 0.75 mg/ml APS 組0.27±0.040.38±0.040.59±0.040.86±0.091)0.81±0.091)0.71±0.091)1.50 mg/ml APS 組0.25±0.040.31±0.041)2)0.41±0.061)2)0.55±0.151)2)0.65±0.081)2)0.51±0.091)2)3.00 mg/ml APS 組0.25±0.040.28±0.031)2)0.36±0.071)2)0.46±0.121)2)0.57±0.101)2)0.42±0.081)2)

圖1 APS 抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 蛋白表達(dá)

2.3 敲低HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖的影響 與si-NC 組相比,si-HDAC7 組MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過(guò)24、48、72 h 的作用后存活率顯著降低(P＜0.05);si-HDAC 7 組MCF-7 細(xì)胞中HDAC7 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),表明敲低HDAC7 能夠抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖能力。見(jiàn)圖2、表2。

表2 敲低HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞HDAC7 表達(dá)及不同時(shí)間點(diǎn)吸光值的影響(±s,n=5)

表2 敲低HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞HDAC7 表達(dá)及不同時(shí)間點(diǎn)吸光值的影響(±s,n=5)

與si-NC 組比較:1)P＜0.05;表3 同

組別HDAC7 mRNAHDAC7 蛋白吸光值0 h24 h48 h72 h si-NC 組1.00±0.090.79±0.090.26±0.040.38±0.040.5 4±0.060.99±0.15 si-HDAC7 組0.56±0.071)0.31±0.061)0.27±0.030.31±0.051)0.39±0.051)0.59±0.081)

圖2 兩組細(xì)胞HDAC7 蛋白表達(dá)

2.4 敲低HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期阻滯的影響 敲低HDAC7,MCF-7 細(xì)胞周期阻滯主要發(fā)生在G0/G1 期;與si-NC 組相比, si-HDAC7 組MCF-7細(xì)胞的阻滯率顯著升高(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 敲低HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期的影響(±s,n=5,%)

表3 敲低HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期的影響(±s,n=5,%)

組別G0/G1SG2/M si-NC 組52.10±6.8034.50±5.0113.40±2.42 si-HDAC7 組68.90±7.111) 19.20±2.311)11.90±3.01

2.5 APS 通過(guò)HDAC7 對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖的影響 與APS+pcDNA-NC 組相比較,APS+pcDNA-HDAC7 組MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過(guò)APS 處理后,通過(guò)敲低HDAC7,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)存活率顯著降低(P＜0.05);與APS+pcDNA-NC 組比較,APS+pcDNA-HDAC7 組MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過(guò)APS 處理后,通過(guò)敲低HDAC7,細(xì)胞中HDAC7 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表4、圖3。

圖3 各組細(xì)胞HDAC7 蛋白表達(dá)

表4 APS 通過(guò)HDAC7 抑制MCF-7 細(xì)胞增殖(±s,n=5)

表4 APS 通過(guò)HDAC7 抑制MCF-7 細(xì)胞增殖(±s,n=5)

與Control 組比較:1)P＜0.05;與APS+pcDNA-NC 組比較:2)P＜0.05;表5 同

組別HDAC7 mRNAHDAC7 蛋白吸光值0 h24 h48 h72 h Control 組1.00±0.110.81±0.090.26±0.060.39±0.080.57±0.091.03±0.15 APS 組0.55±0.071)0.34±0.061)0.25±0.030.31±0.070.41±0.061)0.52±0.091)APS+pcDNA-NC 組0.50±0.080.40±0.060.24±0.070.32±0.040.39±0.080.46±0.07 APS+pcDNA-HDAC7 組0.78±0.092)0.72±0.082)0.26±0.030.36±0.070.52±0.062)0.77±0.092)

2.6 APS 通過(guò)HDAC7 調(diào)控乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期 APS 可通過(guò)敲低HDAC7 從而抑制MCF-7 細(xì)胞的周期阻滯,其主要發(fā)生在G0/G1 期;與APS+pcDNA-NC 組相比較,APS+pcDNA-HDAC7 組MCF-7 細(xì)胞阻滯率顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

表5 APS 通過(guò)HDAC7 調(diào)控乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期(±s,n=5,%)

表5 APS 通過(guò)HDAC7 調(diào)控乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期(±s,n=5,%)

組別G0/G1SG2/M Control 組50.46±6.91 38.58±4.63 10.96±2.16 APS 組69.73±7.031) 18.89±3.111) 11.39±1.16 APS+pcDNA-NC 組 70.12±4.01 17.77±2.09 12.11±1.46 APS+pcDNA-HDAC7 組62.39±5.442) 26.33±3.122)10.98±1.39

3 討 論

乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響了患者的生存周期和生活狀況〔4,5,11〕。目前,乳腺癌的治療主要以手術(shù)切除、放化療為主,但創(chuàng)傷較大,容易引發(fā)多種并發(fā)癥的發(fā)生〔9〕。因此尋找新型低毒、有效的乳腺癌治療藥物至關(guān)重要。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根,其中APS 為主要活性成分之一,在抗腫瘤方面具有明顯的藥理活性〔12〕。細(xì)胞凋亡主要是為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,通過(guò)基因控制細(xì)胞主動(dòng)消亡的過(guò)程,腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展受到多種凋亡蛋白控制〔13〕。李蓉〔14〕研究發(fā)現(xiàn),APS 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要途徑是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2 家族基因蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,通過(guò)上調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的蛋白酶,通過(guò)內(nèi)源性與外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。李楊等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),APS 阻斷了路易(Lewis)肺癌細(xì)胞S期,導(dǎo)致肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。桂壯等〔16〕研究表明,APS 能阻滯胃癌細(xì)胞發(fā)生在G 期,使S 期的細(xì)胞減少,從而抑制癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。同樣,大多數(shù)研究都證實(shí)了APS 可以阻滯癌細(xì)胞于G期,從而延緩癌細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程〔12〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APS 能夠抑制MCF-7 細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且MCF-7 細(xì)胞的周期阻滯主要發(fā)生在G0/G1期。本研究結(jié)果和文獻(xiàn)〔12,16〕報(bào)道結(jié)果一致。

研究表明,組蛋白去乙酰化酶(HDAC) 可以調(diào)節(jié)體內(nèi)組蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡,它的過(guò)度表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔17〕。而HDAC抑制劑(HDACi) 對(duì)HDAC 的抑制作用為腫瘤的治療帶來(lái)曙光, 成為近年來(lái)研究的熱門(mén)話題。研究發(fā)現(xiàn),嚙齒動(dòng)物及人細(xì)胞中HDAC7 表達(dá)的上調(diào)可以使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)化〔18〕。Witt 等〔19〕研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌和卵巢癌中,HDAC7 在癌癥干細(xì)胞中高度表達(dá),并參與干細(xì)胞維持。雖然有證據(jù)表明HDAC7 在腫瘤轉(zhuǎn)化中存在一定的作用,但HDAC7 的遺傳與表觀遺傳變化并沒(méi)有完全闡明〔20〕。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),敲低人類(lèi)乳腺上皮細(xì)胞中的HDAC7,為研究增殖、硬化和腫瘤發(fā)生提供了機(jī)會(huì)〔21〕。本研究結(jié)果表明經(jīng)過(guò)APS 作用后,通過(guò)敲低HDAC7,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上,APS 通過(guò)破壞HDAC7 的穩(wěn)定性,抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的增殖,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。