干擾素-γ通過調節分子伴侶干預人淋巴細胞抗原Ⅱ類表達的機制

馮星源 王熾華 陳謙 彭萬軍 王素利( 三亞市中醫院檢驗科,海南 三亞 57000; 海南省第三人民醫院病理科)

人類淋巴細胞抗原(HLA)基因復合物是人類基因組中最多變的基因區域,它控制機體防護系統對病原體產生免疫抵抗作用,該基因復合物的功能意義主要表現為HLA Ⅰ類和Ⅱ類基因的功能〔1～3〕。HLA 編碼形成Ⅰ類和Ⅱ類肽受體,通過向HLA 異型標記的T 細胞受體提供抗原肽來形成適應性免疫應答,HLA Ⅱ類糖蛋白和HLA Ⅱ類信號通路的其他多肽如:不變鏈和HLA-DM,可以在抗原呈遞細胞(APCs)中發揮協同調控功能〔4〕。HLA Ⅱ類分子與一種Ⅱ型膜蛋白不變鏈相關,Ⅱ型膜蛋白不變鏈具有三種主要的伴侶蛋白功能,首先不變鏈作為同型三聚體與HLA Ⅱ類的3 個Aβ 異質二聚體結合形成非矩陣結構;通過與主要組織相容性抗原(MHC)Ⅱ類溝槽的緊密相互作用,抑制多肽的裝載;不變鏈在其細胞質尾部含有靶向信號,使得非矩陣結構復合物能夠在溶酶體間隔中傳遞〔5,6〕。通過炎癥細胞因子干擾素(IFN)-γ 與APCs 上的受體結合,可以刺激Ⅱ類轉錄活化因子基因的活化進一步激活HLA Ⅱ類的表達,Ⅱ類轉錄活化因子通過與HLA Ⅱ類、不變鏈和HLA-DM 啟動子的結合驅動轉錄調控〔7〕。Ⅱ類轉錄活化因子的調控對于啟動適應性免疫應答至關重要,IFN-γ 對Ⅱ類轉錄活化因子的激活與T 細胞對細胞內細菌和病毒感染的應答啟動一致,Ⅱ類轉錄活化因子對HLA Ⅱ類基因的活化和表達有重要的影響,被喻為HLA Ⅱ類基因的主控制器。若Ⅱ類轉錄活化因子缺乏激活HLA Ⅱ類啟動子即裸淋巴細胞綜合征,導致APCs 細胞表面無法表達HLA Ⅱ類啟動子,HLA Ⅱ類缺失會導致機體對細菌感染的反應能力受損〔8〕。在不同的APCs 組中,HLA Ⅱ類基因的激活和對Ⅱ類信號通路的調控是可變的,HLA Ⅱ類基因的組織特異性調控是通過Ⅱ類轉錄活化因子基因的細胞類型特異性轉錄介導的,其中大部分位于HLA Ⅱ類地區〔9〕。與HLA-B 位點相鄰的一組基因的產物被定義為B 相關轉錄本(BATs),研究發現〔10〕BAT3 編碼的多肽可以調節多種細胞功能,并且發現BAT3 可以調控HLA Ⅱ類表達,IFN-γ 可以調控BAT3 轉錄,通過促進BAT3 和CⅡTA 的核導入,隨后通過轉錄共激活因子激活HLA Ⅱ類基因。本研究探討干擾素(IFN)-γ 通過調節分子伴侶干預人淋巴細胞抗原(HLA)Ⅱ類表達的機制。

1 材料與方法

1.1 原代細胞培養 使用含有10% 胎牛血清(FCS)、1%的抗生素、丙酮酸鈉和HEPES 的DMEM培養基,培養獲取的人黑色素瘤細胞系MelJuSo 和IMRS 人肺成纖維細胞;采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞;使用單核細胞分離試劑盒陰性選擇分離出單核細胞。使用24 孔板用巨噬細胞集落刺激因子(1 000 U/ml)分化單核細胞(1×106個/ml)。

1.2 觀測指標及方法

1.2.1 轉染和CAT 報告試驗 對MelJuSo 和IMRS細胞分別使用X-01 和A-02 程序,通過核分裂器Ⅰ電穿孔細胞,在用于轉染的DNA 混合物中加入4 μg BAT3-敲除載體,轉染48 h 后收集,收集得到的細胞用8 μg DNA jetPEI 轉染試劑在培養皿中進行轉染,生成穩定的MJ-BAT3-V5 和MJ-CⅡTA-V5 克隆體。采用G418 儀器選擇穩定轉染的克隆體,并用流式細胞儀分析檢測V5 基因的表達;采用一種功能報告基因檢測方法,使用Ii-啟動子-CAT 結構作為報告質粒,MelJuSo 和MJ-BAT3-V5 細胞加入5 μg 報告質粒進行轉染,轉染48 h 后酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測CAT 基因的表達。

1.2.2 流式細胞術 室溫下將細胞在乙二胺四乙酸(EDTA)中培養15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,多聚甲醛(PFA)固定,使用Triton-X-100 對細胞進行通透化處理5 min,使用含有2% FCS 和0.05%的疊氮化鈉的PBS 清洗細胞,接下來細胞在4℃下培養20 min,隨后對細胞進行3 次洗滌,使用FACSD 高速細胞分選儀(貝迪醫療公司,德國)從未轉染的細胞中分離綠色熒光蛋白陽性細胞。

1.2.3 Western 印跡、代謝標記和質譜檢測 Western 印跡檢測:細胞在0.5% NP-40 緩沖液中培養,加入細胞裂解液處理后裂解產物經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉移到硝化纖維素膜上,用抗原特異性一級抗體進行檢測。采用辣根過氧化物酶(HRP)-耦聯抗體和ECL Western 印跡試劑檢測原發性抗體結合,隨后進行X 射線顯影。代謝標記:將細胞在不含蛋氨酸的培養基中培養2 h,隨后在1×106個細胞懸浮在200 μl 無蛋氨酸的培養基中,加入2 mmol/L 谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES 和35S-蛋氨酸,在37℃溫度下搖晃細胞30 min。然后將細胞造粒、清洗后,懸浮在1 ml含有非放射性蛋氨酸的培養基中,繼續標記培養4 h。對得到的細胞進行Western 印跡檢測方法如上所述,用2,5-二苯氧唑增強SDS 凝膠,干燥并進行X 射線顯影。使用EasyWin32 軟件對薄膜進行密度掃描,為了獲得線性關系的條帶強度,將IFN-γ 刺激和未受刺激的細胞免疫沉淀凝膠暴露7或36 h。質譜分析檢測:采用MJ-CⅡTA-V5 細胞中的V5 單克隆抗體免疫沉淀CⅡTA-V5,使用12%SDS-PAGE 進行分離,考馬斯亮藍G-250 染色后,選擇具有CⅡTA/BAT3 流動性的蛋白條帶,用胰蛋白酶譜免疫球蛋白(IG)D 試劑盒進行凝膠內胰蛋白酶消化,在質譜分析中從丙烯酰胺凝膠中洗脫出來的多肽通過3000 RSLC 系統分離,質譜分析采用配備納米電噴霧離子源的LTQ-Orbitrap Velos 質譜儀進行ESI-MS/MS 質譜分析。

1.2.4 實時PCR 分析 為了量化BAT3 轉錄的相對數量,使用Oligotex mRNA Mini 試劑盒從1×106個細胞中分離出poly-A-mRNA,并根據試劑盒中說明書的指導,使用定量反轉錄試劑盒合成cDNA,隨后以cDNA 為模版進行實時PCR,PCR 儀設置條件為37℃保持15 min、85℃保持5 s、4℃至最終。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0 軟件行Shapiro-Wilk 檢驗、單因素方差分析、Fisher 精確檢驗。

2 結 果

2.1 BAT3 的缺失對HLA Ⅱ表達的影響 Western印跡檢測了BAT3 耗盡后Ii 的表達情況如圖1 所示,在實驗中,對含有GFP 的細胞進行分類,隨后進行裂解,并對BAT3、Ii 和β-actin 進行Western 印跡檢測,在富含GFP 的裂解細胞樣品中,可以看到BAT3 殘帶,Ii 明顯消失。

圖1 Western 印跡檢測結果

研究BAT3 缺失對HLA Ⅱ表達的影響,采用流式細胞術將HLA Ⅱ類糖蛋白和HLA-DM 與Ii 進行比較結果如表1 所示,為了確認BAT3 敲除的特異性,將miRBAT3-GFP (miR4BAT3) 與另外一個BAT3 靶載體(miR10BAT3)、一個不相關的miRNA對照及編碼GFP 的模擬載體進行了比較,將這兩種miRBAT3 載體導入MelJuSo 細胞后,miR4BAT3 組、miR10BAT3 組Ii、HLAⅡ、HLA-DM 水平均明顯低于模擬載體組(均P＜0.05),miRNA 對照組與模擬載體組Ii、HLAⅡ、HLA-DM 水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 BAT3 缺失對HLA Ⅱ表達的影響(±s,n=20)

表1 BAT3 缺失對HLA Ⅱ表達的影響(±s,n=20)

與模擬載體組比較:1)P＜0.05

組別IiHLA ⅡHLA-DM miR4BAT3 組61±1.211)55±1.271)41±1.231)miR10BAT3 組68±1.301)75±1.261)77±1.211)miRNA 對照組110±0.10110±0.11110±0.11模擬載體組100±0.10100±0.10100±0.11

2.2 過表達BAT3 對HLA Ⅱ成分水平的改變BAT3-V5 轉染細胞組BAT3 水平(7 000±117)高于未轉染細胞組(1 000±110),差異有統計學意義(P＜0.05)。BAT3-V5 轉染細胞組HLAⅡ和Ii 蛋白水平均明顯高于未轉染細胞組(均P＜0.05);HLAⅠ蛋白水平明顯低于未轉染細胞組(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組HLA Ⅱ、Ii 和HLA Ⅰ蛋白水平表達(±s,n=20)

表2 兩組HLA Ⅱ、Ii 和HLA Ⅰ蛋白水平表達(±s,n=20)

組別HLA ⅡIiHLAⅠ100±10100±10100±10 BAT3-V5 轉染細胞組340±45270±5090±35 t 值14.07618.61721.043 P 值未轉染細胞組0.0210.0360.047

2.3 IFN-γ 對BAT3 表達的影響 IFN-γ 刺激MelJuSo 細胞后通過Western 印跡檢測細胞提取物中BAT3 的表達結果如圖2 所示,IFN-γ 刺激48 h后BAT3 蛋白水平明顯升高(P＜0.05)。作為MelJuSo 細胞對IFN 反應的對照,隨著時間的增加檢測出Ii 的表達也增強。通過實時PCR 檢測MelJuSo、IMRS 細胞中BAT3 對IFN-γ 介導的BAT3調控作用。將BAT3 的相對數量歸一化為β-actin水平,IFN-γ 處理使MelJuSo 細胞BAT3 增加6～7倍。IFN-γ 處理使IMRS 細胞增加4～5 倍。見表3。

圖2 Western 印跡檢測不同時間點IFN-γ 對BAT3表達的影響

表3 MelJuSo、IMRS 細胞中IFN-γ 介導對BAT3調控(±s,n=20)

表3 MelJuSo、IMRS 細胞中IFN-γ 介導對BAT3調控(±s,n=20)

組別MelJuSo BAT3β-actin未轉染細胞組-actin IMRS BAT3β 800±110 5 000±100 1 000±110 5 000±100 IFN-γ 轉染細胞組5 400±270 5 000±100 4 000±230 5 000±100 t 值16.40321.05319.05713.771 P 值0.0240.5000.0390.500

2.4 ELISA 檢測CAT 蛋白 IFN-γ 處理誘導細胞會誘導CⅡTA 表達,進而刺激HLA Ⅱ類基因轉錄,通過ELISA 檢測CAT 蛋白的表達,證明過表達的BAT3 影響IFN-γ 誘導的Ii 轉錄調控結果,IFN-γ 誘引內源性CⅡTA 和BAT3 在MelJuSo 和BAT3-V5細胞中表達,刺激Ii 啟動子活性,CAT 蛋白表達比較:IFN-γ+BAT3-V5 細胞(1 000±180)＞IFγ+MJ 細胞(810±150)＞BAT3-V5 細胞(700±110)＞MJ 細胞(200±70),差異均有統計學意義(均P＜0.05)。

3 討 論

HLA 復合體控制著免疫系統對感染的各種反應,HLA Ⅱ類表達異常或缺失往往會引起嚴重自身免疫疾病或引起免疫缺陷的發生。Nakashima 等〔11〕研究發現HLA Ⅱ類基因的基因表達完全受主調控因子CⅡTA 的調控,這種轉活化因子對HLA Ⅱ類基因和少數參與抗原處理的其他基因有顯著的特異性。BAT3 在調節細胞凋亡和控制細胞增殖的穩定因子中發揮著重要作用〔12〕,BAT3 作為熱休克蛋白HSP70 的參與蛋白可調控蛋白的再折疊和其合成的質量控制。研究表明BAT3/BAG6 支持一些抗原蛋白的降解和錯誤定位蛋白的消除,在BAT3 的生命周期中,會發生與其他蛋白質許多的相互作用〔13,14〕。BAG 家族的蛋白(BAT3 被指定為BAG6,因為它含有BAG 基序)已被證明與蛋白酶體亞基、轉錄因子和細胞周期調節因子相互作用〔15〕,通過高通量雜化篩選,可檢測到與BAT3 N 端相互作用的新蛋白,這些蛋白含有調控蛋白降解的結構域基序。BAT3 的作用可能是穩定新合成的蛋白,并通過與其他因素的相互作用將其傳遞到細胞內的細胞間隔中。Takeuchi〔16〕研究表明在胞質中BAT3 與Ubl4a和TRL35 形成穩定的復合物,BAT3 復合物靶向核糖體上的一種尾錨定蛋白底物亞型,具有高度特異性,并將蛋白轉移到TRC40,ATPase TRC40 伴侶蛋白是新近合成的尾錨定蛋白。類似于BAT3 穩定尾部錨定蛋白并將其靶向TRC40 的機制,BAT3 伴侶蛋白CⅡTA 在核糖體上合成并隨后介導與核轉運因子的相互作用,新合成的CⅡTA 通過BAT3 的陪伴可解釋CⅡTA 在BAT3 介導下增加的現象,BAT3從細胞質到細胞核內部的是由在C 端發現的核定位序列介導。Luo 等〔17〕發現BAT3/BAG6 在細胞溶膠中的作用在受到免疫刺激細胞因子IFN-γ 的調控后可以轉變為細胞核內多肽的作用,HLA Ⅱ類定位的BAT3 和CⅡTA 基因均受IFN-γ 調控,通過IFNγ 處理后BAT3 蛋白表達增加,同時IFN-γ 誘導的CⅡTA 升高,但是CⅡTA 水平升高并不增強BAT3 的表達。BAT3 被證明是一種轉錄調控因子,它與CTCFL 形成復合物,調節染色質結構和基因的表達,此外BAT3 與組蛋白乙酰轉移酶p300 結合,促進p53 的后續乙酰化。p300 被CⅡTA 招募到Ⅱ類啟動子中,參與CⅡTA 基因的轉錄。BAT3 在物理上與CⅡTA 相互作用,在IFN-γ 刺激作用后兩種蛋白都轉移到核內,Guillaume 等〔18〕發現IFN-γ 處理MelJuSo 細胞2 h 內CⅡTA 和BAT3 均轉移至細胞核,這一短時間間隔表明IFN-γ 影響細胞質CⅡTA和BAT3 蛋白的穩態水平。BAT3 與CⅡTA 結合隨后啟動HLA Ⅱ類基因轉錄,但BAT3 對HLA Ⅱ類轉錄的直接作用尚未被證實。HLA Ⅱ類的表達在APCs 的異質性組中受到差異調控,BAT3 的伴侶作用可以在APCs 中調控HLA Ⅱ類基因的表達。未成熟的樹突細胞可高度合成HLA Ⅱ類處理通路的成分,一旦病原體激活這種合成就會停止,在B 淋巴細胞中HLA Ⅱ類的本構表達在向漿細胞的終末分化過程中丟失〔19〕。Kosuke 等〔20〕發現IFN-γ 誘導HLA Ⅱ類,通過IFN-γ 刺激巨噬細胞中的BAT3 基因轉錄,BAT3 對CⅡTA 的關鍵影響可能為調控轉錄子提供了一個缺失的環節。本研究表明BAT3 通過陪伴CⅡTA 來調控HLA Ⅱ類表達,CⅡTA 蛋白穩定性的調控為HLA Ⅱ類通路的調控提供了一種新的機制。