基于網絡藥理學探討天南星治療癲癇的作用機制*

李歡，盧玲，廖現秋，何乾超，陳煒，梁霜，刁麗梅△

1廣西中醫藥大學研究生學院,廣西 南寧 530001；2廣西中醫藥大學第一附屬醫院

癲癇是繼偏頭痛、中風和老年癡呆癥之后第四大最常見的神經系統疾病［1］。大約三分之一的癲癇患者對現有的抗驚厥藥物不敏感，極易復發，甚至伴有認知功能障礙，給患者及社會增加了極大的負擔［2］。據流行病學調查研究顯示，中國約有900萬例癲癇患者，而且每年約有40萬例的新發病例［3］。目前臨床上治療癲癇的主要方法包括病因治療、抗癲癇藥物治療及非藥物治療。由于癲癇發病機制至今尚未完全闡明，已知的藥效靶點較少，因此暫無療效確切的治療方案。而中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在癲癇的治療和輔助治療方面具有很大的潛力。

中藥天南星（rhizoma arisaematis）臨床應用十分廣泛，近幾年來，多項研究表明中藥天南星在治療癲癇中發揮重要作用。天南星，別名南星，虎掌南星，為天南星科植物天南星、異葉天南星或東北天南星的干燥塊莖。始載于《神農本草經》，味苦、辛，性溫，有毒，歸肺、肝、脾經，具有祛風止痙，化痰散結的功效，主要用于治療中風痰壅、口眼歪斜，風痰眩暈，頑痰咳嗽等疾病。藥理研究表明，天南星具有鎮痛、鎮靜、抗驚厥、抗心律失常、抗腫瘤、抗氧化、祛痰等作用［4］，然而其抗癲癇的具體作用靶點尚不明確。

網絡藥理學結合了網絡生物學和多藥理學的方法，是尋找新的分子靶點的一種很有前途的方法。在本研究的框架內，通過對現有數據進行分析，篩選出與癲癇相關的基因。采用網絡藥理學方法，從“活性成分-藥物靶標-通路”水平探索天南星治療癲癇的潛在新的藥物靶點及作用機制，可以為中藥單體在臨床抗癲癇的研究中提供更有力的依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源本研究使用的相關分析平臺和數據庫見表1。

表1 相關分析平臺和數據庫

1.2 對天南星活性成分的檢索及篩選本研究借助TCMSP軟件，以“天南星”為檢索詞，檢索其活性成分，根據藥動力學原理［5］，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為活性成分篩選條件，篩查天南星的主要有效活性成分及其靶標，并將所獲得的資料用Excel表格導出。

1.3 天南星作用靶標的獲取及收集采用Perl軟件對相關有效成分作用靶標進行預測，然后導入物種為“人”的Uniprot數據庫查找對應的標準靶標基因名，從而得到天南星活性成分靶標。

1.4 癲癇相關靶標的獲取及與天南星預測靶標的映射利用“epilepsy（癲癇）”為檢索詞，通過Gene Cards數據庫、OMIM數據庫獲取癲癇疾病的相關靶標，刪除重復靶標基因。最后將天南星的預測靶標與癲癇相關靶標進行映射，獲得天南星與癲癇疾病交集靶標的韋恩圖。

1.5 “藥物-活性成分-疾病-靶標”網絡的構建與分析將“1.3”項獲得的天南星治療癲癇的潛在靶標，輸至Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-疾病靶標”調控網絡圖，通過網絡圖直觀展示中藥天南星活性成分與潛在作用靶標之間的關系。

1.6 構建靶標互作網絡圖（PPI圖）及核心靶標的篩選將天南星治療癲癇的潛在靶標導入STRING數據庫并限定研究種類設置為“homosapiens（人類）”，得出蛋白互作網絡圖，保存為tsv文件，將所得文件輸入R語言計算，得到蛋白互作網絡核心靶標圖。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析把天南星與癲癇疾病交集靶標輸入R語言軟件進行天南星活性成分治療癲癇關鍵靶標基因Gene Ontology（gene ontology，GO）生物過程、KEGG信號通路功能注釋富集分析。

2 結果

2.1 天南星活性成分的檢索及篩選本研究根據TCMSP平臺檢索到天南星有效成分123個，相關靶點672個；再將OB≥30%、DL≥0.18對活性成分進行篩選，共獲得天南星的主要活性成分7個，包括8、11、14-二十二碳三烯酸甲酯、24-表蛇甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等。見表2。

表2 天南星的活性成分篩選結果（OB＞30%，DL＞0.18）

2.2 天南星成分治療癲癇的潛在作用靶標預測結果通過TCMSP數據庫中的靶標預測，去除重復靶標后得到天南星活性成分作用靶標40個。通過GeneCards、OMIM數據庫平臺合并去重后獲得癲癇疾病靶標4621個。運用R語言軟件將與天南星相關靶標和疾病靶標取交集，獲得天南星治療癲癇的靶標的韋恩圖，見圖1。最終獲得共同靶標26個，表明天南星可通過多個靶標發揮治療癲癇的作用。

圖1 中藥-疾病靶標

2.3 藥物-活性成分-疾病-靶標網絡構建本次研究運用Cytoscape 3.7.2進行關系網絡繪制分析。結果顯示，中藥天南星主要通過6種有效成分作用于26個癲癇靶標，這26個靶標基因可能影響癲癇的發生。因此本課題組推測中藥天南星治療癲癇不僅是通過多種中藥活性成分作用于不同靶標來實現網絡調節效應，還可能通過潛在作用靶標之間的相互影響，進而產生了復雜的調節關系，從而發揮治療癲癇作用。見圖2。

圖2 中藥-成分-疾病-靶標調控網絡

2.4 中藥-疾病靶標PPI網絡與核心靶標篩選分析結果天南星-癲癇靶標蛋白相互作用網絡圖見圖3。中藥-疾病核心基因按鄰接節點數目由多到少依次為：CASP3、ADRA1B、JUN、MAOA、CASP8、CASP9、MAOB、PTGS2、SLC6A4、ADRB2、BAX、BCL2、PRKCA、SLC6A2、SLC6A3、OPRM1、PGR、MAP2、AKR1B1、CHRM3、GABRA1、KCNH2、NR3C2、SCN5A，見圖4。

圖3 中藥-疾病靶標蛋白相互作用網絡

圖4 中藥-疾病核心靶標的條圖

2.5 關鍵靶標生物功能及通路分析

2.5.1 GO功能富集天南星治療癲癇的關鍵靶標富集顯著的前10個生物學功能主要為類固醇激素受體活性，核受體活性，轉錄因子活性，細胞因子活性，細胞因子受體結合，核糖核酸聚合酶二轉錄因子結合，泛素樣蛋白連接酶結合，脫氧核糖核酸結合轉錄激活活性，激酶調節活性，激活轉錄因子結合等。表明天南星有效成分可以通過調控多種生物學途徑而發揮治療癲癇的作用，見圖5a—5b。

圖5 b GO功能富集分析氣泡圖

圖5 a GO功能富集分析柱狀圖

2.5.2 KEGG通路富集天南星治療癲癇的關鍵靶標基因顯著富集在細胞凋亡-多種信號通路、乙型肝炎信號通路、含血清素的神經突觸通路、人類免疫缺陷病毒1型感染信號通路、p53信號通路、鉑耐藥信號通路、細胞凋亡信號通路、麻疹信號通路、結腸直腸癌信號通路、小細胞肺癌、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、可卡因成癮信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、EB病毒感染信號通路、肌萎縮性脊髓側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路等通路上。結果見圖6a—6b。

圖6 b KEGG通路富集分析氣泡圖

圖6 a KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討論

癲癇在中醫里命名有多種，包括“巔疾”“癇證”或“癇病”等，俗稱“羊癇風”或“羊癲風”。《丹溪心法·癇》指出：“癇證有五，無非痰涎壅塞，迷悶孔竅……”故常將“痰氣逆亂、竅蒙風動”作為對癲癇病機的概括，以化痰熄風，開竅定癇為基本治則［6-7］。天南星為傳統中藥，藥用歷史悠久，作用廣泛，常配伍其他中藥組方治療多種疾病。

本次通過TCMSP數據庫檢索和“藥物-活性成分-疾病-靶標”網絡的構建分析，篩選出天南星中包括β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等在內的7個主要活性成分及靶標40個，在Gene Cards、OMIM數據庫中得到癲癇潛在靶標4621個，與天南星的靶標映射得到天南星治療癲癇的靶標26個，天南星治療癲癇的可能關鍵成分6個。研究表明，天南星的主要活性成分可通過多靶標、多基因影響癲癇的發生，他們之間存在相互協同的關系。天南星治療癲癇的核心基因主要有CASP3、ADRA1B、JUN、MAOA、CASP8、CASP9、MAOB、PTGS2、SLC6A4、ADRB2、BAX、BCL2、PRKCA、SLC6A2、SLC6A3、OPRM1、PGR、MAP2、AKR1B1、CHRM3、GABRA1、KCNH2、NR3C2、SCN5A。這些基因可能通過影響類固醇激素受體活性，核受體活性，轉錄因子活性，細胞因子活性，細胞因子受體結合，核糖核酸聚合酶二轉錄因子結合，泛素樣蛋白連接酶結合，脫氧核糖核酸結合轉錄激活活性，激酶調節活性，激活轉錄因子結合等來調控癲癇。即主要從炎癥因子、細胞因子等分子水平來治療癲癇。炎癥因子可改變神經元興奮性從而誘發神經元異常放電，而神經元長時間放電會造成神經元細胞及膠質細胞功能失調，最終加速細胞凋亡［8］。Caspase蛋白家族是介導細胞凋亡的一類蛋白水解酶，其中Caspase-3在細胞凋亡的執行階段起關鍵作用［9］。研究發現，Caspase-3參與癲癇患者顳葉組織的神經細胞凋亡［10］，Caspase-3的升高可導致癲癇患者認知功能下降［11］。凋亡的發生又與凋亡調控基因Bcl-2、Bax的表達密切相關，而這兩者的異常表達又直接參與癲癇的病理過程［12-13］。GABRA1是γ-氨基丁酸受體，兩者結合可充分發揮神經元興奮抑制作用，具有鎮靜、催眠、抗驚厥等功能［14-15］。

根據KEGG信號通路和GO生物過程富集分析結果，發現天南星治療癲癇的核心基因涉及的KEGG通路眾多。富集明顯的通路主要包括細胞凋亡-多種信號通路、乙型肝炎信號通路、含血清素的神經突觸通路、人類免疫缺陷病毒1型感染信號通路、p53信號通路、鉑耐藥信號通路、細胞凋亡信號通路、麻疹信號通路、結腸直腸癌信號通路、小細胞肺癌、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、可卡因成癮信號通路、EB病毒感染信號通路、ALS信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路等通路上。已有相關文獻報道凋亡信號通路與癲癇的發展聯系密切，凋亡信號通路的異常激活致使神經元凋亡是海馬神經元丟失的主要形式之一［16］。腺苷A1R參與了癲癇發作后海馬神經元損傷過程，它通過降低腺苷A1R活性，增加谷氨酸興奮性，最終誘導神經元調亡［17］。田沁濤等［18］通過建立癲癇模型，發現在兩邊海馬CA1區注射anti-GDNF抗體能夠降低癲癇發作次數，起到神經元保護作用，其機制可能是抑制了GDNF/RET/P53信號通路。可卡因成癮信號通路在癲癇中磷酸化水平明顯變化，可能與多巴胺受體功能有關［19］。ALS信號通路的改變涉及由Nefh編碼的神經纖維細絲蛋白磷酸化的改變，而這個蛋白質則與軸突功能密切相關［20］。上述通路涉及病毒、細菌、細胞凋亡、免疫調節和腫瘤等各個方面。這些通路分別從不同的層面影響癲癇的發生發展。

本研究利用網絡藥理學對癲癇治療靶點、天南星的有效成分及作用靶點與機制進行了初步的篩選與分析，為后續針對天南星治療癲癇的藥效物質基礎與作用機制的研究提供了依據。此外，本研究存在一些缺點，由于篩選條件的限制，只能分析天南星中主要化合物，所以在一定程度上研究結果具有局限性。另外，雖然通過網絡藥理學技術能夠篩選出大量靶點和通路，但這些結果都有待于通過藥理實驗進一步驗證。