基于網絡藥理學探討“蘭州方”治療急性髓系白血病的機制*

唐小龍，楊麗霞，繆延棟，哈武華，米登海，△

1川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000;2蘭州大學第一臨床醫學院；3甘肅省中醫藥研究院

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是危害人類健康的重大疾病［1］。AML是白血病的主要類型，是最常見的成人急性白血病［2］。自20世紀70年代以來，大多數類型的AML的治療方式沒有改變，AML的低治愈率也沒有明顯改善［3］。雖然現在小分子靶向治療、免疫治療及造血干細胞移植等治療方式取得了一定的治療效果，但因高昂的費用而無法普及。因此，尋找普及性高的AML治療藥物是目前的當務之急。

“蘭州方”是國家級名中醫、中西醫結合專家、衛生部突出貢獻專家裴正學教授結合幾十年治療經驗擬定的經驗方，曾治愈一例急性白血病患者，在1974年蘇州全國血液病學術會議上經過研討，被命名為“蘭州方”［4］。“蘭州方”用于臨床多年，但成分復雜，其作用機制仍不清楚。積極探索“蘭州方”中的有效成分、作用機制也許能為AML的治療提供新的啟示。

網絡藥理學是基于多成分和多靶點分析臨床疾病有效組合藥物的方法，非常適合用來闡明復雜的中藥復方對疾病的作用機制［5］。通過計算復方的靶點與疾病相關蛋白的聯系，網絡藥理學可以將復方與疾病的關系呈現出來，為理解復方治療疾病的機制提供整體框架［6］。從“一種藥物，一個靶點”到“多種藥物，多個靶點”，網絡藥理學能充分挖掘復方藥物的治療潛力［7］。

1 資料與方法

1.1 “蘭州方”治療AML的有效成分和靶點及構建網絡通過中藥系統藥理學與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP）［8］收集“蘭州方”的化合物，化合物納入標準為生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類 藥性（drug likeness，DL）≥0.18［9］，并同時收集化合物的蛋白靶點。基于Disgenet、Drugbank、NCBI、OMIM、Pharmgkb和TTD疾病數據庫，通過關鍵詞“acute myelogenous leukemia”和“AML”搜索并采集AML疾病相關基因。通過UniProt數據庫，將“蘭州方”的蛋白靶點轉換為基因靶點。在對藥物以及疾病的基因靶點取交集后，將共同靶點放入Cytoscape，建立“蘭州方”治療AML的有效成分及對應靶點的網絡。

1.2 “蘭州方”治療AML的核心網絡構建將共同靶點置入STRING數據庫，在得到共同靶點之間相互關系的文件后，將共同靶點相互關系導入Cytoscape軟件進行分析。使用CytoNCA插件，計算各個靶點Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、Local Average Connectivity-based method（LAC）、Network（NC）的評分，并篩選出評分大于平均值的靶點構建核心網絡［10］。同時，使用CytoHubba插件中的degree模塊、maximal clique centrality（MCC）模塊和edge percolated component（EPC）模塊構建核心網絡［11］。

1.3 功能富集分析使用R軟件中的“clusterProfiler”［12］“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”包對共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，并將富集結果進行可視化處理。

1.4 分子對接為了進一步探索化合物和靶基因之間潛在的直接作用機制，對靶蛋白及對應的化合物進行分子對接。首先，從PubChem數據庫獲得“蘭州方”中有效化合物的mol2結構作為分子對接配體，從PDB數據庫中獲得AML相關蛋白晶體結構作為受體。然后，使用AutoDock vina對配體和受體進行分子對接，AutoDock vina是一個開源應用，可以實現高效、穩健的分子對接。通常分子結合能≤-5 kcal/mol-1被認為是有效結合，分子結合能越小，表示預測配體和受體結合的能力越強。

2 結果

2.1 “蘭州方”治療AML的有效成分及對應靶點的網絡構建通過TCMSP平臺，檢索了“蘭州方”主要藥物的化合物成分，包括：生地黃、山藥、山萸肉、人參須、太子參、北沙參、黨參、五味子、桂枝、白芍、生姜、大棗、炙甘草、麥冬以及浮小麥，其中麥冬和浮小麥沒有相關資料，因此未被納入后續分析。基于OB≥30%及DL≥0.18，篩選到“蘭州方”中能被人體口服利用的化合物，并通過與AML疾病相關基因取交集，得到與AML直接相關的有效化合物139種，各種藥物含有的化合物以及有效化合物數量見表1。基于Disgenet、Drugbank、NCBI、OMIM、Pharmgkb和TTD疾病數據庫，共查詢到348個AML疾病相關基因，見圖1A。通過取交集，共得到39個“蘭州方”作用于AML的靶基因，見圖1B。為了更好地展示藥物、化合物成分和AML靶基因的相互關系，基于Cytoscape 3.8，將藥物、化合物成分及AML靶基因的相互關系進行分析并構建了網絡圖，見圖1C。通過網絡圖，“蘭州方”與AML靶基因復雜的關系能被清晰的呈現。該網絡圖也清晰呈現了Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin是作用靶基因數量最多的5種化合物。見表2。

圖1 “蘭州方”治療AML的有效成分及對應靶點的網絡構建圖

表1 “蘭州方”中各味藥含有的化合物以及有效化合物數量

表2 “蘭州方”中治療AML作用靶基因最多的5種化合物

2.2 “蘭州方”治療AML的核心網絡使用STRING數據庫，對39個靶基因的相互關系進行分析并保存為TSV格式文件，置入Cytoscape進行分析。基于CytoNCA插件，將臨界值設定為BC＞15.73434343，CC＞0.4，DC＞5，EC＞0.103901334，LAC＞2.666666667，NC＞3.466666667，得到8個核心 基 因，包括：MAPK3、STAT3、TP53、VEGFA、HIF1A、IL1B、CXCL8及PTGS2，見圖2A。隨后，基于cytoHubba插件，再次通過3種拓撲算法“Degree”“EPC”和“MCC”進行分析，不同算法展示的結果幾乎一致，證明了結果的準確性，見圖2B-D。

圖2 “蘭州方”治療AML的核心網絡

2.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析使用GO功能富集分析了39個靶基因的生物學過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF），見圖3A。結果顯示，其主要富集于：細胞對有毒物質和異生物質的反應、活性氧代謝過程、機體對異生物質的反應及代謝過程等。KEGG通路富集分析顯示靶基因主要富集于：鉑類藥物抵抗、癌癥中的miRNA、PI3K-Akt通路、HIF-1通路、癌癥中的轉錄失調、VEGF信號通路、NF-kappa B信號通路。結果中很多通路與腫瘤的發生和發展有關，揭示了“蘭州方”治療AML的潛在機制，見圖3B。

圖3 “蘭州方”治療AML靶基因的GO與KEGG分析

2.4 分子對接使用AutoDock vina軟件模擬分子對接過程。PTGS2被證明是腫瘤發生發展的關鍵基因之一，之前結果也顯示其是“蘭州方”治療AML的核心基因之一，且被多種化合物影響，因此選擇PTGS2編碼的蛋白COX-2進行模擬分子對接。塞來昔布是COX-2的特異性抑制劑，將它與COX-2的結合作為分子對接的陽性對照。通過PDB網站，查詢到COX-2的活性口袋的位置。在確定活性口袋位置后，vina軟件揭示塞來昔布能在該位置與COX-2集合，結合能為-11.0 kcal/mol-1，如圖4A。在同一部位，筆者發現Kaempferol、Quercetin、Luteolin、naringenin、beta-Caro-tene都能與COX-2結合，結合能分別為：-8.9、-8.8、-8.5、-8.9、-7.5 kcal/mol-1。通常結合能≤-5 kcal/mol-1被認為是有效結合，因此，結果提示“蘭州方”中的多種化合物成分與PTGS2等疾病相關靶點有良好的親和性。見圖4。

圖4 “蘭州方”中有效化合物與AML相關基因PTGS2編碼蛋白COX-2的親和性

3 討論

“蘭州方”是裴正學教授通過多年臨床實踐擬定的經驗方，對AML的療效得到了普遍認可［13］。“蘭州方”中藥物成分多達15種，每種藥物中又有許多不同化合物，傳統方法難以解析其作用機制。本研究基于網絡藥理學，構建了“蘭州方”治療AML的網絡圖，探尋了起關鍵治療作用的化合物，探究了治療作用的核心靶點，分析了治療作用的主要富集功能和通路，并通過分子對接，驗證了“蘭州方”中小分子化合物與AML關鍵靶蛋白的相互作用。本研究基于“多種藥物，多個靶點”的基本邏輯思路，驗證了“蘭州方”的有效性和科學性，為“蘭州方”的推廣應用提供了一定的理論依據。

通過構建“藥物-疾病”網絡圖，筆者發現Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin是作用靶點最多的5種化合物。經過詳細查閱文獻，筆者發現Quercetin、Luteolin和Naringenin已經被報導過，可能對AML有良好的療效。CHANG等14］報導 了Quercetin能通 過影 響細胞周期，凋亡和自噬，抑制人白血病HL-60細胞系 的 增 殖。SHI等［15］報 導Quercetin能 通 過VEGFR2和PI3K/Akt通路，誘導AML細 胞凋亡。CHEN等［16］基于結構和虛擬篩選的方法，篩選并驗證了Luteolin能夠有效抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）相互作用激酶1（mitogen-activated protein kinase-interacting kinase 1，MNK1）。SHI等［17］報導Naringenin可能通過抑制Akt和ERK通路，促進JNK和p53通路，增強curcumin誘導的腫瘤細胞凋亡。然而，Kaempferol、Diosgenin及“蘭州方”中的其他化合物沒有被驗證過對AML有治療作用。不過有許多研究報導了Kaempferol、Diosgenin及“蘭州方”中其他化合物在其他腫瘤里的抗癌潛力，為后續的研究提供了可能的方向［18-19］。

通過cytosnape里的CytoNCA和cytoHubba插件，得到了“蘭州方”治療AML的核心基因，包括：VEGFA、MAPK3、IL1B、STAT3、HIF1A和PTGS2等。目前已經有大量研究報導了這些基因與AML之間的關系。VEGFA是抑制血管生成靶向治療的主要靶點，對AML的發生發展起關鍵作用［20］。MAPK3是MAP激酶家族的成員，在信號級聯中起重要作用，與眾多腫瘤的發生發展有關［21］。白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）是白細胞介素1細胞因子家族成員，是炎癥反應的重要介質，參與多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡，也參與多種腫瘤的發生發展，包括AML［22］。信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族成員，能被相關激酶磷酸化，形成二聚體轉移到細胞核中激活轉錄，在眾多腫瘤中都處于高度激活狀態［23］。最近，有報導闡述了STAT3在調節腫瘤免疫反應中發揮著核心作用，靶向STAT3已成為許多癌癥的潛在治療策略［24］。缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1 α，HIF1α）作為細胞對缺氧反應的主要調節因子，激活包括能量代謝、血管生產、細胞凋亡相關基因的轉錄，與眾多腫瘤的發生發展有著密切關系［25］。前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）是前列腺素生物合成的關鍵酶之一，負責參與炎癥和有絲分裂的前列腺素生物合成，在結直腸癌等腫瘤中，PTGS2被證明是有效的治療靶點［26］。因此，基于既往的研究，表明“蘭州方”可以通過影響多個已被證實的有效靶點治療AML。

通過對共同靶基因的GO功能富集分析，發現“蘭州方”治療AML的基因功能主要富集在血管生成、活性氧代謝過程、對有毒物質的反應及代謝過程等方面。血管生成和活性氧代謝是腫瘤發生發展的關鍵表型［27-28］。長期接觸有毒物質，特別是在特定的工作或生活環境中，是誘發腫瘤的關鍵因素之一［29］。本研究結果表明，“蘭州方”可能通過影響以上生物學過程，發揮治療AML的作用。

KEGG富集分析結果表明，共同靶基因的相關通路主要有癌癥中的miRNA、PI3K-AKT信號通路，HIF-1信號通路，VEGF信號通路，NF-KB信號通路等。有文獻報道中藥能夠通過影響miRNA的表達量，改變信號通路中關鍵蛋白的表達，從而治療腫瘤［30-31］，這與我們的研究相似。PI3K-AKT通路已經被廣泛研究，該通路調節細胞增殖、生長、代謝和運動，在癌癥發生發展中普遍被激活，大量研究表明抑制該通路可抑制腫瘤的進展［32］。HIF-1信號通路在機體缺氧狀態下被激活。HONG等［33］報道，中草藥的活性成分能夠抑制HIF-1信號通路，進而抑制腫瘤血管生成。VEGF信號通路主導血管生成，抗VEGF信號通路是腫瘤治療的主要手段之一，有文獻報道穿心蓮內酯能夠通過抑制VEGF信號通路從而抑制乳腺癌發展［34］。NF-κB信號通路參與調節免疫、炎癥和細胞生存，是腫瘤發生發展的關鍵通路。有文獻表明，通過抑制NF-κB信號通路，能夠抑制腫瘤的發展與抗腫瘤藥物耐藥性的產生［35-36］。以上多條信號通路涉及炎癥、免疫調節、血管生成等，且都與腫瘤發生發展關系密切，我們推測“蘭州方”中的活性成分主要通過調節以上多條信號通路發揮治療AML的作用。

筆者采用分子對接方法驗證“蘭州方”中的有效成分與AML中的關鍵靶蛋白的結合能力。PTGS2是核心基因之一，且被“蘭州方”中最多的化合物影響，因此筆者選擇PTGS2進行分子對接驗證。結果證實，多種化合物都與PTGS2的編碼蛋白COX2的活性口袋區域具有良好的親和性，并且進一步說明了“蘭州方”通過“多種藥物、多個靶點”的綜合作用，發揮治療AML的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法，構建了“蘭州方”治療AML的網絡圖，預測起關鍵治療作用 的 化 合 物 為：Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin；治療的核心靶點為：MAPK3、STAT3、TP53、VEGFA、HIF1A、IL1B、CXCL8和PTGS2；潛在治療機制影響的通路包括：PI3KAKT信號通路，HIF-1信號通路，VEGF信號通路，NF-κB信號通路等；并通過分子對接，驗證了“蘭州方”中小分子化合物與AML關鍵靶蛋白PTGS2的相互作用；圍繞“多種藥物，多個靶點”的基本分析策略，驗證了“蘭州方”的有效性和科學性，為“蘭州方”的推廣應用提供了一定的理論依據。