木丹顆粒通過miR-146a調控對糖尿病周圍神經病變大鼠TLR4通路的影響*

姚偉潔，趙香妍

1首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院，北京 100006；2北京市和平里醫院

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）作為糖尿病的常見并發癥之一，在病程后期易導致患者肢端潰爛甚至造成截肢，嚴重影響患者的生活質量［1］。DPN的發病機制復雜，至今尚未完全闡明，有研究發現，炎癥反應參與了DPN的發生發展［2］。木丹顆粒作為臨床治療DPN的常用中藥，治療效果顯著［3-4］。前期研究發現，木丹顆粒治療DPN的機制與抑制Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）相關通路，從而抑制炎癥反應有關，然而木丹顆粒是通過何種途徑調控TLR4通路的至今尚未有深入研究。

相關研究發現miR-146a參與了DPN的發生，并與炎癥反應密切相關［5］。但是木丹顆粒能否通過影響miR-146a的表達，調控TLR4通路改善DPN，至今尚未有研究。本實驗以木丹顆粒為治療藥物，以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的DPN大鼠和高糖環境下培養的雪旺細胞（schwann cells，SCs）為研究對象，將miR-146a作為切入點，探討木丹顆粒調控TLR4通路的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SD雄性大鼠，SPF級，周齡6～8周，體質量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（京）2016-0006。飼養條件：動物飼養于SPF級飼養室，12 h/12 h晝夜交替、溫度（23±2）℃、濕度（55±10）%，自由進食飲水。

1.2 實驗細胞雪旺細胞選擇大鼠RSC96細胞株（American type culture collection），選用dmem（dulbecco's modified eagle medium）完全培養基（培養基中含有4 mM谷氨酰胺，25 mM葡萄糖，1 mM丙酮酸鈉，1500 mg/L碳酸氫鈉，10% FBS及1%青鏈霉素混合液）培養細胞，培養環境為37℃和5%CO2的培養箱中。

1.3 藥品及試劑鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma-Aldrich，批號：S0130）；α-硫辛酸（Puritan's Pride，批號：6007）；木丹顆粒（遼寧奧達制藥有限公司，國藥準字Z20080033，規格：7 g/袋）；D-葡萄糖（Sigma，批號：D7021）；澳洲胎牛血清（Gibco，批號：10099-141）；Trizol試劑（Invitrogen，批號：15596-025）；TransStart Tip Green qPCR SuperMix，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（全式金，批號：AQ141-02、AT301-03）；小鼠單克隆β-actin抗體，兔單克隆TRAF6抗體，兔多克隆IRAK1抗體（Abcam，批號：ab8226、ab33915、ab238）

1.4 實驗儀器CareSens血糖儀（i-SENS）；3K15型低溫離心機（Sigma）；全波長酶標儀（Molecular Devices，SpectraMax Plus 384）；CFX96TM型實時熒光定量PCR儀（Bio-Rid）；PowerPac?型基礎電泳儀電源（Bio-Rid）；Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽（Bio-Rid）；小型Trans-Blot?轉印槽（Bio-Rid）；371型二氧化碳培養箱（Thermo）；MLS-3020型高壓滅菌器（SANYO）。

1.5 動物實驗

1.5.1 造模與分組將SD大鼠40只適應性飼養1周后，隨機分為2組，設10只為空白對照組，其余30只大鼠腹腔注射60 mg/kg的STZ溶液誘導糖尿病模型，穩定1周后空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥16.7 mmol/L的大鼠表明糖尿病模型建立成功。將模型大鼠隨機分為模型組、α-硫辛酸組和木丹顆粒組，每組10只。

1.5.2 給藥方法α-硫辛酸組給予20 mg/（kg·d）的α-硫辛酸溶液，木丹顆粒組給予2.3 g/（kg·d）的木丹顆粒溶液，空白對照組和模型組給予10 mL/（kg·d）劑量的飲用水，連續給藥12周。末次給藥1 h后處死大鼠，收集坐骨神經。

1.6 細胞實驗

1.6.1 含藥血清制備另選SD大鼠30只適應性飼養1周后，隨機分為3組，空白血清組15只，α-硫辛酸含藥血清組5只，木丹顆粒含藥血清組10只。連續干預7天，末次干預1 h后腹主動脈取血，離心半徑13.5 cm，3000 r/min離心10 min，4℃分離血清，60℃水浴滅活后除菌（0.22 μm微孔濾膜過濾除菌），分裝后用于后續實驗。

1.6.2 細胞處理RSC96細胞以4×105細胞/孔的數量接種于6孔板中，將細胞于培養箱中放置過夜，待細胞貼壁后，分別使用空白組大鼠血清、150 mM葡萄糖（Sigma）+空白組大鼠血清、150 mM葡萄糖+10% α-硫辛酸（ALA）含藥血清和150 mM葡萄糖+不同濃度（10%、1%和0.1%）木丹顆粒含藥血清孵育細胞48 h。

1.7 觀察指標

1.7.1 RT-PCR法測定基因表達使用Trizol法分別提取大鼠坐骨神經和RSC96細胞中的總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書，將RNA反轉錄為cDNA，繼續使用SYBR預混系統和特異性引物將cDNA進行RT-PCR擴增，確定每個基因的mRNA表達水平。每個樣本設置3個平行復孔，以β-actin作為內參，對各樣本miR146、TRAF6和IRAK1進行相對表達量分析，計算2-△△Ct目的基因相對表達量，結果以倍數形式表示。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.7.2 Western blot法測定蛋白表達使用RIPA裂解液分別提取坐骨神經和RSC96細胞中總蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。在SDS-PAGE凝膠中使用電泳分離蛋白質，并通過濕式轉移系統（Bio-Rad，USA）將蛋白轉運至0.45 μm PVDF膜上。使用脫脂奶粉室溫封閉蛋白2 h后，加入相應一抗4℃孵育過夜。然后加入相應二抗，室溫孵育1 h后，加入電化學發光（ECL）試劑并在凝膠成像系統（Bio-Rid）中形成圖像。使用Image J軟件計算樣品灰度值，計算蛋白表達，將β-actin作為內標蛋白，結果以倍數的形式表示。使用了以下一抗：兔單克隆TRAF6抗體，兔多克隆IRAK1抗體，小鼠單克隆β-actin抗體。

1.8 統計學方法使用SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料采用±s表示，多組獨立樣本比較使用One-Way ANOVA，非正態分布數據使用非參數檢驗方法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠坐骨神經miR-146a、IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表達與空白對照組比較，模型組miR-146a表達顯著降低（P＜0.01），IRAK1、TRAF6蛋白和mRNA表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，木丹顆粒組miR-146a表達顯著升高（P＜0.01），IRAK1、TRAF6蛋白和mRNA表達均顯著降低（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠坐骨神經IRAK1和TRAF6蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠坐骨神經miR-146a，IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠坐骨神經miR-146a，IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*表示P＜0.01，#表示P＜0.05；與模型組比較，△表示P＜0.01

組別空白對照組模型組α-硫辛酸組木丹顆粒組鼠數10 10 10 10 miR-146a 1.00±0.06 0.35±0.05*0.82±0.05#0.80±0.04#△IRAK1 mRNA 1.00±0.09 1.77±0.08*1.36±0.06*△1.35±0.05*△TRAF6 mRNA 1.00±0.06 1.72±0.03*1.34±0.06*△1.44±0.08*△IRAK1 1.00±0.07 2.20±0.17*1.42±0.05*△1.38±0.04#△TRAF6 1.00±0.10 1.57±0.09*1.27±0.08*△1.23±0.08*△

2.2 高糖環境下雪旺細胞miR-146a、IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表達與25 mM組比較，150 mM組miR-146a表達顯著降低（P＜0.01），IRAK1、TRAF6 mRNA及蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）；與150 mM組比較，木丹顆粒含藥血清組miR-146a表達顯著升高（P＜0.01），10%和1%木丹顆粒含藥血清組IRAK1和TRAF6mRNA及蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），0.1%木丹顆粒含藥血清組IRAK1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表3。

表3 各組含藥血清對高糖環境下雪旺細胞miR-146a、TRAF6、IRAK1蛋白及mRNA表達比較（±s）

表3 各組含藥血清對高糖環境下雪旺細胞miR-146a、TRAF6、IRAK1蛋白及mRNA表達比較（±s）

注：與25 mM組相比，*表示P＜0.01，#表示P＜0.05；與150 mM組相比，△表示P＜0.01，&表示P＜0.05

組別25 mM組150 mM組150 mM+10%ALA組150 mM+10%MD組150 mM+1%MD組150 mM+0.1%MD組樣本量4 4 4 4 4 4 miR-146a 1.00±0.07 0.37±0.04*0.79±0.05*△0.82±0.05#△0.66±0.06*△0.59±0.04*△IRAK1 mRNA 1.00±0.11 1.80±0.05*1.24±0.08#△1.41±0.06*△1.50±0.04*△1.64±0.04*&TRAF6 mRNA 1.00±0.06 1.75±0.10*1.26±0.06#△1.28±0.08*△1.50±0.03*&1.63±0.07*IRAK1 1.00±0.09 2.52±0.20*1.67±0.14*△1.58±0.19#△1.90±0.11*&2.49±0.20*TRAF6 1.00±0.06 1.55±0.04*1.17±0.07△1.23±0.08#△1.12±0.07△1.38±0.04*

圖2 各組含藥血清高糖環境下雪旺細胞IRAK1和TRAF6蛋白表達電泳圖

3 討論

SCs是周圍神經的髓鞘形成細胞［6］，其代謝紊亂易導致神經纖維出現髓鞘脫失，是DPN的主要病理特征［7］。研究發現，SCs容易受高血糖的影響，高糖環境下SCs的損傷和線粒體的功能障礙會導致軸突萎縮，髓鞘脫失等病理改變［8］，因此，可將高糖環境下培養的SCs作為DPN研究的體外模型。含藥血清是由姜廷良教授引入中國的藥理學實驗技術，能夠真實地反映藥物的藥效及其作用環境，在體外實驗中可信度優于中藥粗制劑［9］。因此本實驗的體外實驗采用高糖環境培養的SCs為研究對象，使用木丹顆粒含藥血清為治療藥物干預SCs，結合體內實驗，共同探討木丹顆粒對TLR4通路的調控機制。

DPN的中醫病機以氣滯血瘀為主［10］，木丹顆粒在臨床治療DPN療效顯著［3-4］。方中黃芪為君藥，可使氣旺血行；三七、延胡索為臣藥，功效為活血止痛；佐以赤芍、丹參、川芎、紅花、蘇木和雞血藤，共同達到活血化瘀，通絡止痛的作用［11］。我們在前期實驗中對木丹顆粒治療DPN的機制進行了研究，實驗結果顯示，木丹顆粒能夠抑制DPN大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路和TLR4/p38 MAPK通路，進而抑制炎癥反應，改善周圍神經結構和功能的損傷。

微RNA（MicroRNA，miRNA）是高度保守的內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度20～25 nt，能夠通過靶向信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’UTR區域堿基互補配對，從而抑制或降解靶標mRNA的翻譯和表達［12］。miRNA在病理過程中發揮了重要的作用，能夠作為疾病預警和早期診斷的生物標志物［13］。miR-146a參與急性和慢性炎癥反應的調節已被廣泛證明，有研究發現在miR-146a缺陷型小鼠中觀察到炎癥反應標志物的高表達［14-15］。此外，研究發現miR-146a參與了DPN的發生，并與炎癥反應密切相關［5］。

IRAKl和TRAF6是miR-146a調控的兩個主要靶基因，能夠對炎癥進行負反饋調控［16］。IRAK1和TRAF6是TLR下游通路中的兩個重要分子［17］，TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活能夠誘發炎癥反應［18］，其 中MyD88能 夠 與IRAKl和TRAF6形 成MyD88-IRAKs-TRAF6復合體進行信號轉導，IRAK1和TRAF6的活化會引發NF-κB的核移位，從而促進炎癥反應發生［19-20］。體內實驗和體外實驗均證明，木丹顆粒能夠促進miR-146a的表達，并抑制IRAK1和TRAF6的蛋白和基因表達。

綜上所述，木丹顆粒能夠通過促進miR-146a的表達，進而抑制IRAK1和TRAF6的表達，從而調控TLR4/MyD88/NF-κB通路，抑制炎癥反應，防治DPN。