土家族藥物豆板還陽的HPLC指紋圖譜研究*

張萬濤，李鴻，張鈺，鄭露，涂星

1恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部；3風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心

豆板還陽又稱石豇豆、巖澤蘭、石澤蘭、巖豇豆、巖石茶等，為土家族“七十二還陽”藥材之一，為苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔（Lysionotus pauciflorusMaxim）的地上部分，具有清肺化飲、涼血止血、利濕通絡(luò)、調(diào)經(jīng)活血的功效，用于治療咳嗽、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、痢疾、鉤端螺旋體、燙傷、疳積等［1-3］。現(xiàn)代研究表明，吊石苣苔中主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、植物甾醇和三萜皂苷類、苯丙素苷類等多種成分，以“石吊蘭”項(xiàng)被2015年版《中華人民共和國藥典》第一部收載［4-7］。HPLC指紋圖譜屬于中藥色譜指紋圖譜技術(shù)，它運(yùn)用現(xiàn)代分析檢測技術(shù)，考察中藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、采收部位、炮制加工等信息，在中藥質(zhì)量控制與真?zhèn)蝺?yōu)劣評價(jià)方面發(fā)揮著重要的作用［8］。目前，有文獻(xiàn)對貴州石吊蘭的指紋圖譜特征進(jìn)行了研究和分析，但關(guān)于湖北恩施的豆板還陽的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究擬對恩施8批不同產(chǎn)地的豆板還陽進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析并進(jìn)行相似度比較，為豆板還陽的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥與試劑石吊蘭藥材采集于恩施不同地區(qū)，采集方式均為野外采集，經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部朱敏英副教授鑒定為苦苣苔科植物豆板還陽（Lysionotus pauciflorusMaxim.）的干燥地上部分，來源信息見表1。石吊蘭素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111555-200602，純度：98.1%，HPLC級）；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，純度：99.0%，HPLC級）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-201610，純度：99.1%，HPLC級）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為去離子超純水，其余試劑均為分析純。

表1 豆板還陽樣品來源信息

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器LC-2030C液相色譜儀（日本島津，PDA檢測器）；VS-100UE型恒溫超聲提取儀（無錫沃信儀器制造有限公司）；BT-25S型電子分析天平（德國賽多利斯，d=0.01 mg；BSA224S-CW型，d=0.1 mg）；MilliQ超純水系統(tǒng)（貝徠美生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取P2O5中干燥至恒重的石吊蘭素對照品約10 mg，加甲醇制成100 μg/mL的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備取本品中粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件Inertsustain C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測波長為332 nm，柱溫30℃，乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～25 min，15% A；25～55 min，15%→52%A，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.4 精密度試驗(yàn)取石吊蘭素對照品（36.76 μg/mL）溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以峰面積計(jì)算精密度RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)取鶴峰縣走馬鎮(zhèn)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以石吊蘭素（tR約為52.3 min，分離度R＞1.5）的色譜峰作為參照峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.37%（n=6），相對峰面積的RSD為0.12%～2.97%（n=6），表明該方法的重復(fù)性好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取鶴峰縣走馬鎮(zhèn)樣品，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以石吊蘭素（tR約為52.4 min，分離度R＞1.5）的色譜峰作為參照峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.50%（n=6），相對峰面積的RSD為0.18%～2.91%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 指紋圖譜分析及相似度評價(jià)

2.7.1 參比峰的標(biāo)定分別取不同產(chǎn)地豆板還陽樣品S1～S8，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。獲得湖北恩施不同產(chǎn)地的土家族藥物豆板還陽HPLC指紋圖譜疊加圖，見圖1，共有模式圖見圖2。從共有模式圖可知，8個(gè)不同地區(qū)的樣品中有16個(gè)共有峰，經(jīng)與對照品相比較并結(jié)合對照品的保留時(shí)間，標(biāo)定了16號峰為石吊蘭素（tR約為52.4 min），16號的色譜峰分離度好、峰面積較大、穩(wěn)定性好、為所有樣品共有且石吊蘭素為豆板還陽的主要成分，因此將石吊蘭素峰作為參比峰。

圖1 8批豆板還陽HPLC指紋圖譜疊加圖

圖2 豆板還陽的共有模式圖

2.7.2 相似度評價(jià)將樣品S1～S8的HPLC指紋圖譜測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A版）》軟件中，以樣品宣恩縣七姊妹山（S2）的圖譜為參照圖譜，得出豆板還陽樣品的共有模式圖譜，進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表2。

表2 8批豆板還陽樣品相似度分析的結(jié)果

2.7.3 共有峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積采用相對保留時(shí)間標(biāo)定共有峰，即將16號峰作為參比峰，計(jì)算8批不同產(chǎn)地豆板還陽樣品共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積，結(jié)果見表3—4。

表3 8批豆板還陽樣品共有峰的相對保留時(shí)間

表4 8批豆板還陽樣品共有峰的相對峰面積

3 討論

本研究所用的PDA檢測器可實(shí)現(xiàn)多波長同步分析，經(jīng)等高線圖與光譜圖分析后得出，在此色譜條件下，石吊蘭素最大吸收波長為332 nm。

本研究選擇乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在本研究的色譜條件下各色譜法分離度欠佳、色譜峰拖尾且分析時(shí)間較長。因此將原來的0.05%磷酸水提高到0.1%，比較了0～20 min，10%→20%A、20～30 min，20%A、30～80 min，20%→48%A；0～15 min，10%→18%A、15～30 min，18%A、30～80 min，18%→50%A；0～15 min，10%→16%A、15～30 min，16%A、30～80 min，16%→48%A；0～25 min，15%A、25～55 min，15%→52%A等梯度洗脫方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在梯度洗脫方法：0～25 min，15%A、25～55 min，15%→52%A下，各色譜峰分離度、峰型較好，分析時(shí)長較短，故選擇該方法用于本研究。

在研究中還嘗試用阿魏酸、槲皮素對照品的保留時(shí)間定位8個(gè)樣品中的這兩個(gè)成分，經(jīng)比較得出樣品中含阿魏酸的地區(qū)是：宣恩縣長潭河鄉(xiāng)（S1）、宣恩縣七姊妹山（S2）、咸豐縣高樂山鎮(zhèn)（S4）、宣恩縣高羅鎮(zhèn)（S7）、鶴峰縣走馬鎮(zhèn)（S8）；含有槲皮素的地區(qū)是：咸豐縣高樂山鎮(zhèn)（S4）、建始縣花坪鄉(xiāng)（S6）、宣恩縣高羅鎮(zhèn)（S7）、鶴峰縣走馬鎮(zhèn)（S8）。造成這些地區(qū)化學(xué)成分的差異因素，還有待今后進(jìn)一步研究論證。

恩施各地區(qū)的豆板還陽總體藥材質(zhì)量差異較大，且與海拔、經(jīng)緯度關(guān)系不大，推測其化學(xué)成分的含量可能與生長環(huán)境和樣品的采集時(shí)間關(guān)系較為密切。因此，固定產(chǎn)地，建立豆板還陽的良好農(nóng)業(yè)規(guī)范（good agricultural practices，GAP）藥材基地，對提高豆板還陽化學(xué)成分的含量、保障其質(zhì)量的穩(wěn)定性較為關(guān)鍵。

結(jié)合圖1—2結(jié)果，各色譜峰分離較好，各成分基本相同，建立的方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，為以后豆板還陽的真?zhèn)舞b別、資源開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。