農作物遺傳育種中RAPD 技術的應用分析

黎永丹

（貴州醫科大學神奇民族醫藥學院，貴州 貴陽 550004）

農作物育種是放大其基因優勢，改良作物生長態勢，保質增收，為我國農業現代化發展賦能的重要科研項目。隨著我國“菜籃子”工程的持續推進，相關研究人員應合理應用RAPD 技術，充分發揮其在保護農作物遺傳多樣性、純度鑒定以及標記育種中的優勢，保證各類農作物品種與資源確定的便捷性和科學性，為農業生產提供更高質量的育種服務，更好地保證農作物持續供應，解決在農業生產中存在的育種問題。

1 RAPD 技術的原理與優劣勢

1.1 原理

RAPD 本質上是一種全新并切實有效的遺傳標記，其應用原理是通過對于一系列堿基序列存在不同的隨機引物針對基因組DNA 展開PRC 擴增，然后利用凝膠電泳對擴增產物DNA 片段所具有的多態性進行分析，在其中存在的擴增片段分別表示基因組上的各個位點，其所展現出的多態性能充分展現出相應區域DNA 所具有的多態性。RADP 所使用的DAN 序列整體呈現出一定的差異性。在基因組DAN 上，不同的特定引物都包含著相應的結合位點，若基因組在上述區域產生DNA 片段插入或者是缺失等現象，便有可能會導致其特定結合位點的分布出現變化。在此過程中，擴增產物在大小及數量等方面均會隨之出現變化。工作人員進行PRC 檢測便能完成對基因組DNA 多態性的合理檢測工作。對于單一引物來說，僅能實現對于基因組特定區域DNA 多態性的檢測，通過一系列引物則能夠使得檢測區域逐漸實現對整個基因組的全方位覆蓋。基于此，科學使用RAPD 技術能幫助工作人員全方位開展對于基因組DNA 的多態性檢測工作，還能將其作為依據建立起相應的DNA 指紋圖譜。

1.2 優劣勢

其一，優勢。引物自身不存在種屬特異性，采用一套隨機引物能有效應用在不同作物基因組的分析。同時，合理使用RAPD 構建基因圖譜不會涉及克隆問題，其在實際應用過程中能展現出更加簡便、快速的特點，并且分析工作還可以實現自動化，不會產生過于繁雜的程序，在應用時也不會產生過大的DNA 用量，對于一次反應來說僅需要10～50 ng 模板。

其二，劣勢。RAPD 屬于一種顯性標記，無法有效區分純合子以及雜合子，所以在試驗過程中往往呈現出相對較差的重復性以及穩定性。除此以外，該技術還面臨共遷徙問題，僅能夠分開長度存在差異性的DNA 片段，但對長度相同但堿基序列各不相同的片段難以達到預期效果。工作人員在正式應用該技術時，需要在充分發揮出其應用優勢的同時盡可能避免其劣勢[1]。

2 RAPD 技術的改進

2.1 改進擴增程序

改進擴增程序是RAPD 分子標記方法改進的重要組成部分。模板DNA 處在94 ℃變性解鏈—36 ℃使得引物和模板退火—72 ℃擴增，還要經歷至少45 圈的循環，通過應用相關物質實現對于產物的染色，并采用紫外光對其展開檢測工作，該程序往往要花費4 h 以上，若處理樣品較多，便需要擴大在PRC 擴增方面所投入的時間。

完成優化改進的擴增程序，94 ℃1 min 的變性時間縮短為10 s，經驗證，這一時間長度能夠基本上滿足RAPD 反應中模板解鏈的需求。與此同時，短時間變性還可以獲取更加具有豐富性以及清晰性的擴增電泳條帶圖譜。這主要是因為在94 ℃環境中，Taq 酶在一段時間之后依然能夠保存一定的活性，但從實際情況來看，其生命活性的實際跨度始終存在局限性，當其反復經歷較長時間的變性之后，最終勢必會導致催化活性降低，所以縮短原有的變性時間能夠在一定程度上強化其催化活性，可以為PCR 反應創造良好的條件[2]。

同時，工作人員還可以將復性時間維持在30 s 左右。相關研究結果顯示，30 s 的退火溫度能夠充分同RAPD 反應過程中引物同模板之間的配對結合相適應，并且不會對最終的擴增效果造成負面影響。對于電泳條帶圖譜形式來說，擴增時間這一參數對于其影響較大，結合相關研究可知，其延伸在實踐方面的長短同PCR 反應中的最大擴增判斷大小之間存在一定的關系。若延伸時間能夠維持在5～10 s，便呈線性關系。延伸時間為5 s 足夠使其擴增0.6 kb 大小的片段，而當其時間延伸到60 s 之后便能夠出現3 kb 的擴增片段。在充分考慮節省時間的基礎上還應當確保其在EB 染色之后能夠出現方便進行熒光亮度較高的條帶，擴增時間隨機確定，最終證明其效果良好。循環次數的多少對于擴增程度有一定影響，但經過試驗證明，循環35 圈和45 圈相比，在最終的試驗結果上并不存在突出的差異性。在完成改進工作之后的擴增程序之后，一次RAPD 反應的時間大概要經歷2 h，所以能夠節省2 h，從絕大部分引物擴增結果來看，可以在極大程度上提升電泳條帶檢出效果。

2.2 提高穩定性

為了有效提升試驗過程中RAPD 技術應用的穩定性，相關工作人員需要加強對于模板的控制，要合理把控模板DNA 本身所具有的純度。從目前的實際情況來看，PCR 技術本身作為一種重要的DNA 擴增方法，有相對較高的敏感性，一般來說，在常規PCR 反應中會將模板控制在102～105 拷貝的靶序列。

通常情況下，在1 ng 的大腸桿菌DNA 中的拷貝數總共包含3×105個靶分子，所以能夠得出在模板中包含小量的外源污染，其對于最終RAPD 的試驗結果有著較大的影響。因此，在正式開展試驗的過程中需要保障所選用的DNA 抽提方法效率較高，能真正實現對模板純度的合理控制，為RAPD 反應奠定堅實的基礎。PCR 擴增儀器的使用同樣會對試驗最終結果造成一定影響，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行染色，能夠在原有基礎上促進RAPD 自身分辨率以及靈敏度的進一步提升，并且對于保障RAPD 技術應用的實效性以及穩定性有重要意義[3]。

3 RAPD 技術在農作物遺傳育種中的應用——以番茄作物為例

3.1 鑒定品種純度

現如今鑒定農作物種子純度經常會應用RAPD 技術，應用該技術比傳統的化學法以及形態學等具有一定的特殊性。一是植物組織不論處在哪一個發育時期，都能夠對其進行分析。二是應用該技術不僅能明確各個品種之間遺傳因子的差異，還可以充分展現出母體細胞質非孟德爾遺傳因子影響。三是能夠直接針對基因核苷酸組成展開相應的探測工作，無論其DNA 序列是否存在編碼，都能利用探針展現，并且整體具有較高的準確性以及靈敏性。四是分離的DNA 樣品需要在特定的時間范圍內對其開展長時間的保存工作，此舉能夠為追溯性以及仲裁性鑒定等工作的開展提供支持。除此以外，相關工作人員可以結合現有條件制備大量DNA，為后續長期應用提供支持。針對普通番茄而言，其本身屬于一種自花授粉植物，在實際雜交育種階段常會出現母本自交的現象，進而出現假雜種的現象，這一現象是工作人員在控制種子純度過程中需要著重解決的問題。應用RAPD 技術主要是建立RAPD 擴增產物圖譜，然后再鑒定品種的純度以及真實性，在實施階段能有效減少在時間以及人力成本方面的過度消耗，并且不會產生過多的樣品需求，能夠在任何發育期都實現應用。相關研究人員在試驗中選取了3 個番茄品種的F1 雜交種展開了相應的分析工作，對各個雜種的DNA 進行了RAPD 分析，在多個隨機引物中合理篩選兩個引物，以便于有效區分母本以及雜種一代，最終結果表明，可以在雜種鑒定方面使用RAPD 技術。

相關研究人員通過應用RAPD 技術，對普遍種植在我國東北地區的兩個番茄雜種展開了純度鑒定工作，從100 個引物當中尋找5 個引物進行純度鑒定，應用該方法具有一定的簡單性和適用性。部分人員在試驗中采用番茄F1 代雜交品種的干種子作為材料，使用RAPD 技術初步實現對于種子自身純度的鑒定。其所選用的RAPD 引物是在眾多個隨機引物中所篩選出的BA1072，在正式使用該方法的過程中不用開展田間種植便能夠鑒定番茄雜種的純度，并確保其具有較高的純度。研究人員可以基于RAPD 技術實現對番茄體細胞無性系變異的有效鑒定，在未經篩選的葉片中提取DNA，然后構建起可以同番茄RAFD 分析相適應的PCR 條件，可以立足于多個隨機引物，在其中尋找能夠進行番茄品種體細胞無性系變異的引物。合理使用該方法對體細胞無性編譯鑒定，能夠切實提升其快速性以及簡單性；同時，因為本身并不涉及較大的DNA 用量，所以不會對后續被檢植株的正常生長造成影響，可極大程度地提升選擇效率。

3.2 種質資源研究

番茄野生種具有良好的抗病蟲能力，科學使用DNA 分子標記法合理進行番茄屬種質資源研究，能夠高效應用在品種資源保存以及鑒定等相關工作上。目前，多樣化的分子標記方法已經實現了在品種純度分析、番茄品種鑒定以及種植分析等多方面的廣泛應用，具體包括SSR 標記、RFLP 標記及RAPD 標記等。

國外專家使用RAPD 技術對秘魯和智利等多個番茄種展開了聚類分析工作，結果表明，PC 同EC 所具有的遺傳背景存在相對較明顯的差異，在EC 中的紅果以及綠果劃分基本上能夠符合RFLP 標記的分析結果。不同材料的番茄也有不同的遺傳背景，這一結果也符合現階段的研究成果，RFLP 和RAPD 分類結果基本上同番茄形態學分類的有關研究成果相一致。我國研究人員針對番茄屬的43 份材料展開了相應的RAPD分析工作，通過聚類分析能夠使番茄本身劃分成4 個類群。在綜合分析基因雜合度以及遺傳封堵等指數的基礎上，能夠明確相對于普通番茄類群野生類群有更為突出的遺傳多樣性，這也在一定程度上表明野生類群中富含著更加豐富且能夠在番茄育種中實現高效應用的遺傳資源[4]。

相關研究人員應用RAPD 技術對部分番茄品種展開了比較和研究工作，對各個品種之間所存在的遺傳差異進行詳細分析，合理采用41 個RAPD 引物對大量品種進行分析，最終得出了98 個多態性RAPD 標記。從實際情況來看，智利、秘魯以及厄瓜多爾等地區的品種在差異性方面要遠比其他來源的品種大，對于普通番茄來說，品種的差異性大多是受到所在地理區域不同的影響。研究人員通過觀察種質庫中的29 份番茄材料，明確了其中有19 對以上的變異，其對于不同的基因重組來說存在著較大的潛力，可以進一步展現出種植資源庫本身具有保存遺傳多樣性的能力。

3.3 基因分子標記

當前，RAPD 技術多應用在番茄基因分子標記中，根據抗病基因以及性狀基因進行標記工作，可有效對育種以及定位起到輔助作用。在番茄生長過程中，煙草花葉病毒是主要病原之一，經常開展抗TMV 基因標記工作，根據抗病基因的具體位置，可使重組率下降。在近等基因的組建下，包含Tm-2 產生的代群體，結合多個隨機引物對Tm-2 基因標記進行挑選，大約19%的近等基因產生多態性，并取其中引物進行分析，發現69%的引物產生多態性與nv 基因分離現象。

在RAPD 技術的研究下，對抗TMV 基因座展開深入分析，并建立不同標記，形成完整的單拷貝序列。同時，在RAPD 技術的應用過程中，可有效獲取與番茄抗TMV 基因的分子標記。在分離群體內運用相關分析方法可對番茄分子標記進行探究，由此可獲得連鎖分子標記，遺傳距離為7.067 cm。在感病以及抗病的基因中隨機挑選引物。其中，OPK-6 能夠擴增出特異片段，將該片段進行再次組合能夠形成PCR 引物。利用該引物可在兩個品系中繼續擴增，以形成相應片段，將小片段與RAPD 片段雜交，并對不同品系內的片段回收測序，可充分發現酶切位點，將片段切為不同片段，由此獲取SCAR 標記，將此標記運用到群體分析中，確保分析結構與實際檢測結果保持相同。

同時，利用抗病以及感病系列進行群體檢驗，標記番茄黃化卷葉病毒的QTL 基因，抗病中帶有細葉抗番茄黃化卷葉病毒基因。在此系列中，挑選出抗性較強的以及感病最強的F4 系，將其合理組成基因池，對不同基因池以多個引物進行分析。其中，42%左右的引物可出現多態片段，出現該情況的主要原因是親本遺傳差距相對較大，其由不同野生番茄所摻雜。通過檢驗多態引物，可得出相應引物與抗病性保持聯系，其他引物則呈現隨機分布的狀態。在對RAPD 標記分析下，充分表明其處于相同的連鎖群體內，其在抗番茄黃化卷葉病毒中所占比例大約為27.7%。在普通番茄以及潘那利翻群體下，充分運用BSA 方法合理挑選隨機引物，從而得到相應的多態RAPD 引物[5-6]。

4 結論

通過應用RAPD 技術可以更好地豐富、保存和改良農作物的遺傳基因。在RAPD 技術的未來發展中，應進一步結合克隆技術、轉基因技術等生物科學技術，為農作物育種提供更完善、科學、高效的育種服務，保證廣大農民獲得更多的經濟效益，確保我國農業朝著智慧轉和高質量方向發展。同時，應加深在農作物種質資源上的研究，發揮RAPD 技術的育種優勢，以此保證我國的種質資源管理工作的規范化和科學化發展，提高種質分類的準確性以及效率水平。