基于IL-1β探討矢志方對高尿酸血癥小鼠腎組織OAT1/3表達的影響

王傳旭，周嘉寶，吳志遠，吳燕升，郭亞芳，高建東

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海中醫藥大學中醫腎病研究所，上海中醫藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032；3.復旦大學附屬浦東醫院，上海 201399

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸生成過多或排泄減少，導致血清尿酸水平升高超過其臨界值的一種代謝性疾病[1]。尿酸被認為是慢性腎臟病腎損傷的獨立危險因素，高水平尿酸誘導的炎癥反應是腎小管損傷的中心機制[2-3]。目前臨床常用降尿酸藥物黃嘌呤氧化酶抑制劑如非布司他、別嘌醇，促尿酸排泄藥物如苯溴馬隆，長期服用存在一定不良反應[4-6]。

尿酸在多種信號通路中發揮促炎作用，可溶性尿酸和尿酸結晶均可激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體，通過白細胞介素（IL）-1β等細胞因子觸發免疫反應[7]。尿酸主要通過腎臟排泄，其在腎小管的重吸收和分泌是由不同轉運蛋白完成，其中有機陰離子轉運蛋白（OAT）1和OAT3是表達于腎小管的功能蛋白，在腎小管尿酸分泌中起關鍵作用[8]。肝細胞核因子（HNFs）首先被鑒定為肝臟所富含的轉錄因子，之后發現其在其他多個組織和器官中表達，發揮調節發育和器官功能作用[9]。研究表明，HNF1α、HNF4α參與OAT1和OAT3的調控[10-11]，IL-1β又可抑制HNF1α/HNF4α及其下游靶基因表達[12-13]。抑制IL-1β信號通路可減輕炎癥，還可促進OAT1、OAT3表達，減輕腎損傷，發揮保護腎臟作用[14-15]。

矢志方是上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎內科臨床經驗方，具有化痰祛濕、活血化瘀功效。研究表明，矢志方治療痰濁瘀阻型尿酸性腎病具有較好臨床療效，并可通過清除或抑制氧自由基改善尿酸性腎病氧化應激狀態，保護腎功能[16-17]。此外，矢志方通過抑制活性氧及下游NLRP3-ASC-Caspase-1通路激活，減少IL-1β、IL-18活化和釋放，減輕HUA腎小管炎癥損傷[18]，降低血尿酸水平[19]。因此，本實驗通過氧嗪酸鉀灌胃建立HUA小鼠模型，基于炎癥因子IL-1β觀察矢志方對HUA小鼠腎組織OAT1、OAT3及HNF1α、HNF4α表達的影響，為明確矢志方治療HUA的作用機制提供更多依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠32只，8周齡，體質量12～22 g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，溫度25℃，相對濕度45%，12 h光照，自由攝食飲水。本實驗經上海中醫藥大學倫理委員會批準（PZSHUTCM211227011）。

1.2 藥物

矢志方（車前子30 g，芥子15 g，王不留行15 g，冬葵子15 g），飲片購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院，并委托國家中藥制藥工程技術研究中心制備成中藥復方顆粒劑（1 g顆粒相當于原方20 g），使用時用蒸餾水配制成70 mg/mL藥液。非布司他片，40 mg/片，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號20130081，將藥片粉碎，以蒸餾水溶解，配制成0.75 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀、羧甲基纖維素鈉（CMCC-Na），上海麥克林生化科技有限公司，貨號分別為P831461、C10097951；IL-1β，武漢ABclonal有限公司，貨號A16288；HNF1α抗體，英國Abcam公司，貨號分別為ab272693（Western blot）、ab268116（免疫熒光）；HNF4α抗體，英國Abcam公司，貨號分別為ab201460（Western blot）、ab41898（免疫熒光）；OAT1抗體，英國Biorbyt公司、美國Immunoway公司，貨號分別為orb11177（免疫熒光）、YT3220（Western blot）；OAT3抗體，英國Biorbyt公司、北京博奧森，貨號分別為orb136646（免疫熒光）、bs-0609R（Western blot）；β-actin，美國Proteintech公司，貨號66009-1；HRP標記山羊抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG，上海碧云天，貨號分別為A0216、A0208、A0423、A0473；PVDF膜，美國Millipore公司，貨號IPVH00005。離心機，美國Beckman公司，型號Avanti J-E；凝膠成像系統，上海天能，型號Tanon-5200；生物組織冷凍包埋機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-BM；烘片機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-H；酶標儀，美國BioTek公司，型號Synergy 2；組織勻漿器，上海凈信科技有限公司，型號JY-24；顯微鏡，日本奧林巴斯，型號CX33。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥

32只小鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常組、模型組、非布司他組和矢志方組，每組8只。正常組予生理鹽水灌胃，其余各組予250 mg/kg氧嗪酸鉀溶液灌胃制備HUA小鼠模型。4 h后非布司他組灌胃非布司他藥液6 mg/kg，矢志方組灌胃矢志方藥液562.5 mg/kg，給藥劑量為成人劑量的9倍，灌胃體積0.2 mL，每日1次，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，造模與給藥同時進行，連續2周。

2.2 取材

第13日給藥后小鼠禁食不禁水，第14日給藥后，0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，摘取雙側腎臟，切去腎盂，剩余腎組織分別用于病理觀察、Western blot和免疫熒光染色。

2.3 病理觀察

小鼠腎組織經4%中性固定液固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度4μm），脫蠟后進行HE、Masson染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察小鼠腎組織病理形態。

2.4 Western blot檢測

取20 mg小鼠腎組織，加入RIPA裂解液200μL，勻漿機65 Hz勻漿1 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer和生理鹽水配制成濃度為40μg/μL的等量蛋白樣品。上樣，120 V電泳1 h，300 mA、1 h轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入IL-1β一抗（1∶1 000）、HNF1α一抗（1∶1 000）、HNF4α一抗（1∶1 000）、OAT1一抗（1∶1 000）、OAT3一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4℃孵育過夜；PBST洗膜3次，加入HRP標記山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，ECL化學發光法顯影，凝膠成像系統拍攝。以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

2.5 免疫熒光染色

腎組織石蠟切片經脫蠟、脫水，微波爐抗原修復后，1%BSA室溫封閉1 h，加入1%BSA稀釋的IL-1β一抗（1∶200）、HNF1α一抗（1∶1 000）、HNF4α一抗（1∶1 000）、OAT1一抗（1∶400）、OAT3一抗（1∶400），4℃孵育過夜；加入熒光二抗（1∶500），避光孵育1 h，加入DAPI染細胞核5 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，計算陽性表達的面積比。

3 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件和Image J 1.8軟件進行分析。實驗數據以±s表示，多重比較采用方差分析和LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 矢志方對模型小鼠腎組織病理形態的影響

HE、Masson染色結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎小管管壁變薄，管腔擴張，間質炎性細胞浸潤，纖維組織增生；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎小管管壁變薄、管腔擴張、炎性細胞浸潤、纖維組織增生的病理變化減輕。見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠腎組織形態（HE染色，×200）

圖2 各組小鼠腎組織形態（Masson染色，×200）

4.2 矢志方對模型小鼠腎組織白細胞介素-1β、有機陰離子轉運蛋白1/3、肝細胞核因子1α/4α蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎組織IL-1β蛋白表達顯 著 升 高（P＜0.001），OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，非布司他組和矢志方組小鼠腎組織IL-1β蛋白表達顯著降低（P＜0.05），OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1、圖3。

圖3 各組小鼠腎組織IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白免疫印跡

表1 各組小鼠腎組織IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達比較（±s）

表1 各組小鼠腎組織IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組非布司他組矢志方組只數4 4 4 4 IL-1β 0.51±0.10 1.20±0.20***0.85±0.11#0.77±0.18#OAT1 1.90±0.13 0.29±0.17***0.72±0.18#0.92±0.25##OAT3 1.21±0.28 0.36±0.08**0.95±0.10#0.94±0.25#HNF1α 0.98±0.02 0.06±0.02**0.75±0.25#0.36±0.19#HNF4α 0.99±0.05 0.12±0.01***0.74±0.10##0.51±0.10#

4.3 矢志方對模型小鼠腎組織炎癥因子白細胞介素-1β表達的影響

免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織IL-1β表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎組織IL-1β表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖4、表2。

表2 各組小鼠腎組織IL-1β陽性表達比較（±s，%）

表2 各組小鼠腎組織IL-1β陽性表達比較（±s，%）

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001

組別正常組模型組非布司他組矢志方組只數4 4 4 4 IL-1β 0.05±0.02 0.92±0.20***0.28±0.09###0.21±0.02###

圖4 各組小鼠腎組織IL-1β陽性表達（免疫熒光染色，×200）

4.4 矢志方對模型小鼠腎組織有機陰離子轉運蛋白1/3、肝細胞核因子1α/4α表達的影響

免疫熒光染色結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.001）；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見圖5、圖6、表3。

表3 各組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3陽性表達比較（±s，%）

表3 各組小鼠腎組織HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3陽性表達比較（±s，%）

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

組別正常組模型組非布司他組矢志方組只數4 4 4 4 HNF1α 2.85±0.75 0.24±0.05***1.44±0.21##1.40±0.14##HNF4α 3.77±0.46 0.93±0.14***1.96±0.22##2.09±0.23###OAT1 12.63±1.16 2.17±0.64***4.42±1.05#8.49±0.92###OAT3 13.12±1.16 1.70±0.70***4.93±0.83###8.63±0.64###

圖5 各組小鼠腎組織HNF1α、OAT1陽性表達（免疫熒光染色，×200）

圖6 各組小鼠腎組織HNF4α、OAT3陽性表達（免疫熒光染色，×200）

5 討論

HUA血尿酸水平升高與腎小管損傷相關，當血尿酸水平超過正常范圍，可引起腎小管多種病理變化，如炎癥、凋亡和纖維化等[20-22]，進一步促進慢性腎臟病腎損傷的發展。體外實驗顯示，尿酸可誘導腎小管上皮細胞NLRP3、IL-1β及腫瘤壞死因子-1α水平升高[23]。動物實驗也顯示，尿酸誘導大鼠腎臟巨噬細胞浸潤，IL-1β表達增加，最終導致腎小管結構和功能損傷[24-25]。OAT1與OAT3通過有機陰離子與二羧酸的交換發揮排泄尿酸作用[26]。在敲除OAT1的小鼠中，腎小管分泌尿酸鹽功能減弱[27]；在單側輸尿管梗阻模型中也發現因腎小管炎癥損傷導致的OAT1和OAT3表達下降，而多種中藥及其提取物通過抑制炎癥相關信號通路，促進轉運蛋白表達減輕HUA腎損傷[7，14-15]。

本實驗通過氧嗪酸鉀灌胃建立HUA小鼠模型。2周后，腎小管出現管壁變薄、管腔擴張、腎組織纖維化等病理改變，炎癥因子IL-1β表達升高，OAT1、OAT3及HNF1α、HNF4α表達降低，提示HUA小鼠腎組織出現炎癥損傷，腎小管轉運功能下降，并伴有纖維化改變。給予矢志方治療后，HUA小鼠炎癥反應、腎組織損傷減輕，腎小管轉運功能改善，纖維化病理改變減輕。

中醫學認為，濕濁痰瘀是HUA的基本病機，痰瘀互結可能與HUA導致腎小管炎癥損傷、尿酸排泄障礙有關。據此創立化痰祛濕、活血化瘀中藥復方矢志方。該方以車前子、芥子為君藥，利濕化痰、祛痰散瘀；配伍王不留行為臣，逐瘀通絡，使瘀血化、痰濕去；佐以冬葵子利水消導，使邪有去路，津行得通。諸藥合用則水道通利、脈道得通、血行得暢，共奏化痰祛濕、活血化瘀功效。

綜上所述，矢志方可減輕HUA小鼠腎臟損傷，其機制與抑制腎組織炎癥因子IL-1β，促進OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α表達有關。此外，HNF1α、HNF4α在矢志方調控IL-1β-OAT1/3中的具體機制還需進一步探索。