干眼寒燥證大鼠模型建立與驗證

陳立浩，陳雄，彭清華，姚小磊，彭俊，湯鈺

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.河北省眼科醫院，河北 邢臺 054001；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；4.中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；5.湖南省中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術研究中心，湖南 長沙 410208

干眼是由多因素導致的眼表疾病，其特征在于淚膜穩態喪失，并伴有眼部干澀、異物感、燒灼感、視疲勞及視力波動等癥狀，部分患者會出現眼睛局部疼痛，影響視覺功能及生活質量。淚膜的不穩定性、高滲性、眼表炎癥和損害及神經感覺異常是其主要病因[1]。干眼患病率較高，不同地區發病率有一定差異。日本一項研究表明，超過半數眼科門診患者患有干眼[2]，其中，女性和高齡人群是干眼發生的高危人群，與體內激素水平下降有關[3-5]。

干眼與環境有關?，F代醫學認為干燥環境能使眼表淚液蒸發過快，從而導致干眼發生。中醫學認為“燥勝則干”。燥分內外，其中外燥包含寒燥、熱燥，熱燥傷津所致干眼肺陰不足證較常見，常采用滋陰潤燥法治療。寒能生燥，即寒冷干燥環境能誘發、加重干眼。目前，國內有學者從病因角度構建了燥證模型[6]，但未檢測模型動物眼部指標，不能確定是否對眼表淚液分泌、淚膜破裂時間，以及動物瞼板腺狀態、角膜狀態有所影響。本實驗建立干眼寒燥證大鼠模型，并通過以方測證驗證模型是否成功，為建立穩定可靠的干眼寒燥證模型提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康7～8周齡SD大鼠36只，雌性，體質量（200±20）g，湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號430727211100971767。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會審批（LLBH-202105070002）。

1.2 藥物

增液湯合四味大發散（玄參15 g， 生地黃10 g，麥冬10 g，麻黃5 g，藁本5 g，蔓荊子5 g，細辛3 g，生姜5 g），飲片購于湖南衡岳中藥飲片有限公司，所有飲片混合后加水煎煮，過濾，濃縮至原藥材濃度為0.29 g/mL，冷藏保存。艾條，湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL試劑盒，貨號C1088，上海碧云天生物；淚液檢測濾紙條，批號20100040，天津晶明新技術開發有限公司；超敏發光液，貨號RJ239676，美國賽默飛；蘇木素染液，貨號ZLI-9610，北京中杉金橋；伊紅染液，貨號G1100，北京索萊寶。低溫低濕小動物逆境實驗箱（型號NJYW-518D，寧波江南儀器廠），裂隙燈顯微鏡（型號SL-D8Z，日本日立），手持裂隙燈（型號KJ5S1，中國康捷），熒光顯微鏡（型號CKX53，日本Olympus），切片機（型號2235，德國Leica）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

大鼠適應性喂養1周后，使用淚液檢測濾紙條檢測淚液分泌量，剔除極端低值大鼠12只，剩余24只采用隨機數字表法分為空白組、模型組、中藥組和灸法組，每組6只。

空白組在正常溫度、濕度下以常規飼料喂養，其余3組進行造模：設置低溫低濕小動物逆境實驗箱溫度12℃、濕度20%，每日將大鼠置于實驗箱中10 h以上，連續21 d，造模過程中及時更換墊料。大鼠可出現畏寒、蜷縮體態，飲水量、尿量增加，毛發枯黃，尾靜脈發紫等情況。

2.2 干預

第22日開始干預，中藥組以增液湯合四味大發散5.89 g/kg灌胃，每日1次，連續7 d；灸法組懸灸大鼠上下眼瞼，隔日1次，每次10 min，共4次；空白組和模型組不干預。干預過程中，除空白組外，其余各組參照造模方法繼續在低溫低濕環境中飼養。

2.3 眼表體征采集

分別于第1、7、21、28日檢測各組大鼠淚液分泌量及淚膜破裂時間；觀察大鼠造模前后角膜熒光素染色、特征性舌象。

2.3.1 淚液分泌量

腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，將淚液檢測濾紙條底端置于大鼠右下眼瞼1/3結膜囊處，5 min后取出，迅速測量試紙濕長。

2.3.2 淚膜破裂時間

大鼠麻醉后，將熒光素鈉溶液滴至大鼠右下眼瞼內，對大鼠進行瞬目輔助操作2～3次。通過裂隙燈鈷藍光記錄淚膜破裂時間（以角膜出現第1個黑色干燥斑點的時間為準）。

2.3.3 角膜熒光素染色

將熒光素鈉溶液滴至大鼠右眼結膜囊內進行角膜熒光素染色，用裂隙燈顯微鏡在鈷藍光下觀察角膜變化。角膜損傷部位可見嫩綠色著色。

2.4 舌象記錄

采用裂隙燈顯微鏡自帶相機記錄大鼠造模前后舌象。

2.5 HE染色

干預結束后，頸椎脫臼法處死大鼠，分離淚腺組織，剝離瞼板腺，置于4%多聚甲醛中固定。取出組織，流水沖洗，70%、80%、90%乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。石蠟切片烤片，脫蠟，水化，蘇木素染液染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

2.6 TUNEL染色

石蠟切片放入65℃烤箱中烤2 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各放置10 min脫蠟，梯度乙醇水化，滴加蛋白酶K工作液，37℃反應30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加TUNEL染色液，42℃避光孵育1 h；PBS洗去多余染色液，滴加DAPI避光孵育3 min染核，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數/總細胞數）。

3 統計學方法

采用SPSS23.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，組內比較用t檢驗，組間比較方差齊用單因素方差分析，方差不齊用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 淚液分泌量檢測結果

造模第7、21日，與空白組同一時點比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；造模第21日，與本組第1日比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）。與空白組同一時點比較，模型組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；與模型組同一時點比較，中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量增加（P＜0.05）；與本組第21日比較，中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠淚液分泌量比較（±s，mm）

表1 各組大鼠淚液分泌量比較（±s，mm）

注：與空白組同一時點比較，*P＜0.05；與本組第1日比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組同一時點比較，#P＜0.05；與本組第21日比較，☆P＜0.05

組別空白組模型組中藥組灸法組只數6 6 6 6第1日11.83±2.79 11.17±3.43 14.00±3.58 10.83±2.78第7日12.17±2.04 7.33±1.21*7.50±2.07*△△7.00±1.41*△第21日11.50±2.59 4.33±1.63*△4.00±1.55*△△3.50±5.83*△△第28日10.67±2.42 2.67±1.03*8.50±1.52#☆9.00±2.83#☆

4.2 淚膜破裂時間檢測結果

造模第21日，與空白組同一時點比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；與本組第1日比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）。干預7 d后（第28日），中藥組和灸法組大鼠淚膜破裂時間較模型組及本組第21日有所增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠淚膜破裂時間比較（±s，s）

表2 各組大鼠淚膜破裂時間比較（±s，s）

注：與空白組同一時點比較，*P＜0.05；與本組第1日比較，△P＜0.05

組別空白組模型組中藥組灸法組只數6 6 6 6第1日7.33±1.63 6.50±1.87 8.17±1.72 7.00±2.10第7日7.67±1.63 4.83±2.23*4.67±2.73 5.00±1.67第21日7.50±0.84 4.00±2.37*△3.33±1.21*△2.67±1.03*△第28日8.00±1.79 3.17±1.72*4.67±1.63 4.33±1.51

4.3 角膜熒光素染色結果

造模前大鼠角膜清澈，未見損傷；造模后大鼠角膜混濁，出現不同程度的點狀、片狀侵損。見圖1。

圖1 造模前后大鼠角膜熒光素染色

4.4 舌象觀察結果

造模前大鼠舌淡紅，苔薄白；造模后大鼠舌象發生一定變化，主要表現為舌苔由濕潤變干燥和舌體萎縮，尤其是舌體前1/3處凹陷。見圖2。

圖2 造模前后大鼠舌象

4.5 HE染色結果

空白組大鼠瞼板腺腺泡呈細長或球形，腺泡周圍可見毛細血管；模型組大鼠瞼板腺腺泡紊亂，部分細胞核丟失，大量間充質細胞聚集；中藥組和灸法組大鼠瞼板腺腺泡紊亂情況有所改善。見圖3。

圖3 各組大鼠瞼板腺形態（HE染色）

空白組大鼠淚腺組織結構正常，細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠淚腺組織有大量炎性細胞聚集；中藥組和灸法組大鼠淚腺組織炎性細胞浸潤明顯減少。見圖4。

圖4 各組大鼠瞼板腺和淚腺形態（HE染色）

4.6 TUNEL染色結果

與空白組比較，模型組大鼠瞼板腺和淚腺組織細胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和灸法組大鼠瞼板腺和淚腺組織細胞凋亡率顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5～圖7。

圖5 各組大鼠瞼板腺和淚腺組織細胞凋亡率比較（±s，每組6只）

圖7 各組大鼠淚腺組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×400）

圖6 各組大鼠瞼板腺組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×400）

5 討論

干眼與眨眼、瞼板腺、睡眠、白內障、屈光矯治、眼瞼整形、藥物、環境等因素有關，治療方法包括替代與對癥支持、免疫抑制等，但效果并不理想。干眼屬中醫學“白澀”“神水將枯”“干澀昏花”等范疇。常見證型包括肺陰不足證、肝經郁熱證、氣陰兩虛證、邪熱留戀證[7]。隨著社會發展，人們工作和生活習慣發生改變，長時間使用電子設備使眼睛長期暴露于干燥環境中，出現干眼[8-9]。按照《中國干眼專家共識：定義和分類（2020年）》中的發病原因和危險因素分類，屬于環境因素性干眼[10]。中醫認為，寒燥與熱燥有所區別，夏季空調冷氣環境或北方寒冷干燥的冬季氣候屬于寒燥環境，可從寒燥論治[11]。

淚膜是覆蓋于眼球表面的一層液體，屬中醫津液。干眼患者或脂質層受損致淚液蒸發過快，或水液層缺乏導致淚液不足，或黏蛋白層遭到破壞使淚膜不穩。故干眼可看作津液異常所致，屬中醫津液病范疇。影響津液的病理因素眾多，其中以燥邪最為直接。久處空調冷氣環境，易感受風、寒、燥邪，三邪相持，發為干眼?！霸镆讉颉保L燥灼耗上部（眼部）津液，導致眼淚生化無源。《素問病機氣宜保命集·病機論》有“寒能收斂，收斂則燥澀皴揭”，寒性收引凝結，風寒襲肺，使津液運行停滯，無法正常發揮滋潤濡養功能，也會出現“干燥”的外在表現，即“寒能生燥”。由寒燥環境誘發或加重的干眼，病機當屬外感寒燥，治以滋陰潤燥聯合解表，以宣通眼部玄府。此法既能潤燥，又能發散風寒邪氣。若久病陰陽兩虛，需在此基礎上聯合溫陽，陰陽并補。上海中醫藥大學附屬龍華醫院眼科鄒菊生教授在滋陰生津基礎上采用宣通玄府治療干眼[12]。其自擬方寒溫并用，除熟地黃、黃精、沙參、麥冬等滋陰之品外，還使用西河柳、浮萍、紫蘇葉、石菖蒲通竅發汗利水，巴戟天溫陽行氣。張殷建教授繼承鄒菊生教授學術思想，擅于運用發汗解表法治療干眼，獲得良效[12]。

常見干眼動物模型包括轉基因干眼動物模型，如干燥綜合征NOD小鼠、OPN轉基因小鼠模型、人源化SS小鼠模型、缺乏結膜杯狀細胞Spdef-/-小鼠的黏蛋白缺乏型干眼模型[13]。破壞特定部位可進行干眼造模，如燒灼瞼板腺引起瞼板腺功能障礙，從而形成蒸發過強型干眼[14]；摘除淚腺可致淚液缺乏型干眼[15]；局部滴用含防腐劑苯扎氯銨的滴眼液可損傷角膜上皮細胞制備干眼模型[16]；利用去勢方式可以制備激素缺乏所致干眼模型[17]；采用藥物誘導，如東莨菪堿競爭性抑制淚腺M受體，抑制淚液分泌[18]；肉毒桿菌毒素抑制突觸前膜與神經遞質囊泡的融合，阻斷汗腺、淚腺神經肌肉和膽堿能神經連接[19]；使用雄激素受體或拮抗劑灌胃可制備雄激素缺乏型干眼模型[20]。

利用環境因素也可制備干眼模型。Barabino等[21]將小鼠暴露于相對濕度18.5%±5.1%、溫度21～23℃、氣流15 L/min環境，建立了由低濕度環境誘導的干眼模型。Seo等[22]將小鼠置于濕度為15%的環境中，聯合皮下注射氫溴酸東莨菪堿（5 mg/mL）誘導干眼模型。

相較而言，使用轉基因干眼動物模型簡單方便，但費用昂貴，經濟性較差。藥物誘導、環境因素誘導等方式兼具方便性和經濟性?？筛鶕嶒災康倪x擇不同的造模方式。

本實驗將寒燥與干眼創新性結合，建立干眼寒燥證大鼠模型。利用低溫低濕小動物逆境實驗箱配合干燥劑局部使用，能夠減少大鼠淚液分泌量和淚膜破裂時間，且出現眼表損傷。造模后大鼠舌象由濕潤變干燥，出現舌體前1/3萎縮、凹陷，提示肺臟虛損。肺主行水，濡潤雙目，肺虛則津液匱乏，目失所養，發為干眼。舌證相符。寒燥對應中醫治法為溫潤，增液湯合四味大發散治法可歸納為滋陰、解表、溫陽。中藥干預后，大鼠淚液分泌量增加，淚膜破裂時間延長，眼表體征改善，說明方證對應，干眼寒燥證模型構建成功。灸法用于干眼治療效果突出，且優于人工淚液[23]。本實驗將灸法組作為陽性對照組，結果顯示中藥組和灸法組在抑制淚腺、瞼板腺炎癥及細胞凋亡程度上作用相近。

本實驗也存在諸多設計不足：在以方測證中未使用經典名方或公認方劑，結果說服力不足。溫潤法是參照上海中醫藥大學附屬龍華醫院鄒菊生教授等對干眼的治法，但其自擬方中部分藥物臨床使用較少，增液湯合四味大發散是由經典名方增液湯與眼科專方四味大發散化裁而成，臨床療效尚可，故實驗設計時選擇使用該方。另外，北方冬季氣候寒冷干燥，但室內多屬熱燥，因此模型與實際不完全相符，而與夏季頻繁使用冷空調狀態更契合。今后，本課題組將從微觀層面進一步探索干眼寒燥證模型的免疫、凋亡機制，研究不同濃度方藥對本病的療效。