PCR檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物毛絨分析鑒別中的應(yīng)用進(jìn)展

韓 軍，耿 榕，孫 旸，王 超，孫 敬

（北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院/國(guó)家紡織及皮革產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，北京 100025）

動(dòng)物毛絨纖維是畜牧業(yè)的重要產(chǎn)品，被公認(rèn)為高檔的紡織工業(yè)原材料，具有保暖性好、彈性好、吸濕性好、手感柔和等優(yōu)點(diǎn)[1]。毛絨制品的品質(zhì)極高且具有良好的服用性能和保暖性能，深受廣大人民的喜愛[2]。但是個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)為了追逐利益、降低成本，將低值、低質(zhì)的纖維混入動(dòng)物毛絨中，進(jìn)而出現(xiàn)含量虛假的動(dòng)物毛絨制品，破壞了消費(fèi)市場(chǎng)，損害了人民群眾的利益，因此，準(zhǔn)確鑒別毛絨極其重要[3]。傳統(tǒng)的毛絨鑒別方法有顯微鏡法、溶液法和光譜分析法等，但誤判率較高[4]。紡織面料的毛絨有羊毛、羊絨、兔毛、狐貍毛等，由于分屬不同動(dòng)物，物種間存在基因差別，檢測(cè)脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）可以作為鑒定毛絨的有效途徑。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)具有特異性好、多態(tài)性強(qiáng)、易于觀察等特點(diǎn)，近年來，已廣泛用于毛絨的鑒別研究。本研究介紹了DNA檢測(cè)技術(shù)和毛絨基因組DNA提取方式，并對(duì)PCR檢測(cè)技術(shù)在毛絨分析鑒別中的應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。

1 DNA檢測(cè)技術(shù)

DNA是生物體正常運(yùn)轉(zhuǎn)和發(fā)育必不可少的生物大分子，其含有大量生物體所必需的遺傳信息。世界上有羊、熊貓等各類動(dòng)物，還有微小的病毒、細(xì)菌、真菌，這個(gè)豐富的世界無一不與DNA有關(guān)[5-6]。DNA分子結(jié)構(gòu)呈雙螺旋狀，兩條多脫氧核苷酸鏈圍繞一個(gè)中心軸盤繞。脫氧核糖-磷酸鏈在螺旋結(jié)構(gòu)的外面，堿基朝向里面。兩條多脫氧核苷酸鏈反向互補(bǔ)，通過堿基間的氫鍵形成的堿基對(duì)相連，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。DNA中的核苷酸的堿基排列順序構(gòu)成遺傳信息。

DNA不僅存在于生物的細(xì)胞核內(nèi)，還存在于葉綠體和線粒體內(nèi)，含量較少，需要將其擴(kuò)增后才能進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。PCR最大的特點(diǎn)是能使微量的DNA大幅增加，即在生物體外復(fù)制特定的DNA，是一種用于擴(kuò)增放大特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)[7]。因此，無論是古生物化石還是現(xiàn)在動(dòng)物或人類的血液、毛發(fā)，只要能分離出微量的DNA，就能用PCR進(jìn)行放大。PCR是利用DNA在體外95 ℃高溫變性，變成單鏈，在60 ℃左右時(shí)引物與單鏈基于堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再將溫度調(diào)至72 ℃左右，使DNA聚合酶沿著5'→3'的方向合成互補(bǔ)鏈。

DNA檢測(cè)技術(shù)包括PCR法、分子雜交技術(shù)、基于DNA結(jié)合蛋白方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等，其中，廣泛用于毛絨分析鑒別的是PCR法。實(shí)時(shí)定量PCR法是被眾多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的一種方法，其基于PCR擴(kuò)增，引物和特異性熒光探針同時(shí)加入，在增加擴(kuò)增產(chǎn)物的同時(shí)，熒光信號(hào)一同增強(qiáng)，通過對(duì)PCR體系產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控并進(jìn)行定量分析[8]。定量PCR可實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物含量，且PCR后的處理工序簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)操作周期短、操作難度較低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)。

DNA片段用特異設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)材料時(shí)，若檢測(cè)其多態(tài)性，則需要對(duì)相應(yīng)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切處理。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)是采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，然后用限制性內(nèi)切酶將目標(biāo)檢測(cè)DNA進(jìn)行酶切，限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性DNA序列后進(jìn)行切割，使用電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析后，由限制酶圖譜分析次段序列的特異性切位點(diǎn)，通過比對(duì)酶切片段的多樣性，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來源基因序列的差異性分析[9]。簡(jiǎn)而言之，就是先將目標(biāo)DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，進(jìn)行電泳分析后再觀察，通過比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。

2 毛絨基因組DNA的提取方法

毛絨基因組DNA抽提的關(guān)鍵在于破壞毛絨外層的角質(zhì)層，進(jìn)而釋放出毛干中極少量的DNA。常用的毛干DNA提取方法有以下4種：Chelex-100法、PCR法、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）-裂解液法和試劑盒法等。

2.1 Chelex-100法

Chelex-100是一種化學(xué)螯合樹脂，主要成分為苯乙烯和二乙烯苯共聚體，含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子，可與多價(jià)離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，對(duì)高價(jià)金屬離子的親和力和螯合作用更強(qiáng)。在堿性、低離子強(qiáng)度和煮沸的條件下，該物質(zhì)可以使細(xì)胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，通過離心操作，可以去除Chelex顆粒，將DNA與Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)分離。Chelex-100能有效去除非核酸有機(jī)物，可用于提取血痕、全血、精斑、精液、毛發(fā)等樣品中的DNA。呂雪峰等[2]和邵碧英等[3]各自的研究團(tuán)隊(duì)利用Chelex-100法成功提取了羊絨和羊毛中的DNA。劉艷艷等[10]將Chelex-100法與其他提取方法進(jìn)行比較，并成功提取了狐貍、駱駝、山羊、綿羊等8種動(dòng)物毛絨的基因組DNA。

2.2 PCR法

PCR法是一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可以將生物體外的特殊DNA片段進(jìn)行復(fù)制，使微量的DNA大幅增加。使用PCR緩沖液、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解提取液，不僅可以從羊絨毛干中快速提取DNA，還能有效進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。

2.3 DTT-裂解液法

DTT是一種小分子有機(jī)還原劑，其用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護(hù)劑。在DNA溶液中加入DTT，反應(yīng)一段時(shí)間后除去，可以抑制DNA的二聚化。在高濃度DTT條件下，動(dòng)物纖維經(jīng)活性蛋白酶K預(yù)處理后，被裂解緩沖液裂解而釋放出線粒體DNA，然后用順磁性樹脂將DNA吸附，接著用洗滌緩沖液將樹脂上殘留的雜質(zhì)洗掉，最后用洗脫緩沖液將樹脂上結(jié)合的線粒體DNA洗脫下來，完成羊毛羊絨中DNA的提取[12]。

2.4 試劑盒法

DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，為了進(jìn)行測(cè)序、雜交、基因表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，獲得高分子量和高純度的基因組DNA是重要前提，因此，基因組DNA的提取是分子生物學(xué)技術(shù)中最重要、最基本的操作之一。目前，很多公司能提供用于毛絨基因組DNA提取的試劑盒。邵碧英等[3]使用組織和毛發(fā)DNA提取試劑盒，同時(shí)配有蛋白酶K和DTT，成功提取了羊絨和羊毛織品中的DNA。費(fèi)靜等[13-14]使用Promega DNA IQTM毛發(fā)DNA抽提試劑盒成功提取了兔毛、狐貍毛和羊絨中的DNA。王玫[15]使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0試劑盒對(duì)兔毛中的DNA進(jìn)行了提取。向海等[16]使用進(jìn)口商業(yè)試劑盒（QIAamp?DNA Investigator）對(duì)牦牛、山羊、綿羊等動(dòng)物毛干纖維中的DNA進(jìn)行了提取。

3 毛絨的分析鑒別

毛絨的生長(zhǎng)受到了遺傳信息的控制，而DNA是遺傳信息的載體，應(yīng)用DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)毛絨進(jìn)行分析鑒別正是基于此原理。據(jù)研究報(bào)道，毛絨的DNA遺傳物質(zhì)主要存在于線粒體內(nèi)，所以在鑒別過程中要合理選取遺傳物質(zhì)。為避免外源生物的干擾，研究人員要非常注重基因組DNA的獲取過程，并不斷提高方法的特異性。PCR檢測(cè)技術(shù)的精確度很高，但成本高、速度慢，對(duì)人員和設(shè)備技術(shù)要求高。因此，該類方法目前只運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室中，尚未在行業(yè)內(nèi)普及[17-19]。

李好磊等[9]采用PCR-RFLP技術(shù)，利用提取的羊絨和羊毛線粒體基因組DNA，根據(jù)Cytochrome b基因已知的DNA序列設(shè)計(jì)引物，使用內(nèi)切酶Ssp Ⅰ進(jìn)行酶切并得到不同長(zhǎng)度片段，借助酶切圖譜鑒別羊毛和羊絨樣品。劉艷艷等[10]針對(duì)狐 貍、兔、綿羊、駱駝、山羊等8種動(dòng)物毛絨，建立了多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系，方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。費(fèi)靜等[13-14]和Tang等[20]使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立羊毛、兔毛、狐貍毛、羊絨、牦牛絨等動(dòng)物纖維的定量分析方法。王玫等[15]借助熒光定量PCR技術(shù)，建立了兔毛定性檢測(cè)方法。向海等[16]使用PCR法建立了牦牛、山羊、綿羊等動(dòng)物毛干纖維中的DNA引物擴(kuò)增、測(cè)序和特異引物擴(kuò)增檢測(cè)的系列方法，可用于毛絨的分析鑒別，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。陳國(guó)培等[21]開發(fā)了適用于羊絨羊毛制品的DNA提取方法，建立了熒光PCR檢測(cè)方法，該方法特異性較好、檢出限較低、靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)方法。除上述實(shí)驗(yàn)室研究外，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)陸續(xù)發(fā)布了毛絨DNA檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，分別是GB/T 36433—2018《紡織品 山羊絨和綿羊毛的混合物DNA定量分析 熒光PCR法》和GB/T 40903—2021《紡織品 DNA分析法鑒別某些特種動(dòng)物纖維 山羊絨、綿羊毛、牦牛絨及其混合物》，也極大地推動(dòng)了PCR檢測(cè)技術(shù)在紡織品檢驗(yàn)檢測(cè)行業(yè)的應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

PCR檢測(cè)技術(shù)具有設(shè)備先進(jìn)、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但也具有成本較高、操作復(fù)雜、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、對(duì)人員技術(shù)水平要求高等劣勢(shì)。因此，相關(guān)檢測(cè)技術(shù)尚不能被廣泛運(yùn)用于紡織品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。但是，開發(fā)和使用DNA檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)毛絨檢驗(yàn)方法的有效補(bǔ)充，可以作為重要的輔助和確證手段，有助于提高檢測(cè)機(jī)構(gòu)的鑒別能力、檢驗(yàn)水平和準(zhǔn)確率。隨著科技水平的不斷提升和DNA檢測(cè)方法研究的不斷深入，毛絨檢驗(yàn)檢測(cè)行業(yè)也許很快迎來新時(shí)代。