肌萎縮側索硬化診斷標志物的研究進展

周益毅 徐仁伵

(1南昌大學第一附屬醫院神經內科，江西 南昌 330006；2江西省人民醫院神經內科)

肌萎縮側索硬化(ALS)是一種同時累及上、下運動神經元的致死性神經系統退行性疾病。由于ALS疾病起病隱匿，早期臨床表現缺乏特異性，且目前為止尚缺乏特異性診斷標志物，從而導致該病的早期診斷困難。有國外報道顯示ALS患者的平均診斷延遲時間為8～14個月，因此，各國學者一直致力于尋找各種有價值的診斷標志物，以助于ALS患者的早期診斷及評估疾病的進展和預后。本文對ALS診斷標志物的研究進展進行綜述。

1 基因診斷標志物

5%～10%的ALS患者具有家族遺傳性，稱為家族型ALS(FALS)，其余90%～95%為散發型ALS(SALS)。其中FALS通常為常染色體顯性遺傳，其遺傳方式遵循典型的孟德爾遺傳定律，少數為常染色體隱形遺傳或X染色體遺傳。自從1993年SOD-1基因(編碼超氧化物歧化酶1)作為首個被發現的ALS致病基因以來，已相繼發現了30余個FALS致病基因。其中編碼超氧化物歧化酶(SOD)-1、編碼泛素樣蛋白(UBQLN2)、編碼C9orf72蛋白等致病性主要是由于基因突變導致其編碼的蛋白失去原有構型或發生錯誤折疊，導致蛋白功能異?；蛐纬僧惓＞奂铩Ｈ饬鋈诤系鞍谆?FUS)、Senataxin(SETX)基因、血管生成素基因(ANG)、TAR DNA-結合蛋白基因(TDP-43)、異構核糖核蛋白A1基因(hnRNPA1)、基質蛋白3基因(MATR3)等主要通過影響DNA的損傷修復及RNA的代謝過程導致ALS發病。Alsin基因、遺傳性痙攣性截癱11型(SPG11)基因、纈絡胺酸蛋白基因(VCP)、SQSTM1基因的突變則主要影響自嗜-溶酶體功能，出現神經元內穩態異常，進而導致神經退行性疾病發生。CHCHD10基因突變可導致線粒體DNA穩定性異常，影響線粒體的復制和功能穩定性，也被認為是ALS可能的致病基因之一〔1〕。在ALS致病基因中，SOD1基因突變約占FALS病例的20%，SALS病例的5%；TDP-43和FUS約占FALS基因突變的5%；ANG約占FALS的1%；其他突變基因較為少見〔2〕。雖然明確的基因突變占全部ALS的比例相對較少，但對于突變基因的研究有利于人們進一步了解ALS的病理過程并探究可能的發病機制和治療方法。隨著全基因組關聯研究(GWAS)和二代測序(NGS)的廣泛應用，將會有越來越多的致病基因被發現，而這些基因標志物將有助于ALS的早期診斷。

2 體液診斷標志物

ALS的體液診斷標志最常來源于腦脊液和血液。由于腦脊液與中樞神經系統直接接觸，通過檢測腦脊液中的生物標志物可直接反映中樞神經系統損傷情況。而且腦脊液獨立于機體的其他系統，受干擾因素較血液等其他組織標本少，因此腦脊液中的ALS相關標志物具有更高的特異性，且多與疾病進展相關。而血液為基礎的標志物則可能來自透過血腦屏障的顱內標志物，也可能來源于身體其他器官在ALS病理反應下產生的特異性標志物。由于血液的獲取較腦脊液更加便捷，因此從血液中尋找具有診斷意義的ALS標志物也成為一個重要研究方向。

2.1神經絲蛋白 神經絲蛋白是目前作為研究ALS癥和其他神經疾病的理想生物標志物之一。神經絲蛋白是細胞骨架結構蛋白，當軸突損傷時可進入腦脊液和血液，由于其穩定性較好，易于通過免疫方法進行檢測。多項研究表明，在ALS患者腦脊液中磷酸化神經絲重鏈(pNFH)不僅具有診斷價值，還可用于評估疾病進展及生存率〔3〕。Weydt等〔4〕檢測了有癥狀和無癥狀ALS相關基因C9orf72攜帶者的腦脊液pNFH和神經絲輕鏈(NFL)水平，發現有癥狀的突變攜帶者中檢測到pNFH和NFL水平升高，但在無癥狀的ALS突變攜帶者中均未檢測到pNFH和NFL水平升高。而這與攜帶C9orf72重復擴增者的ALS發病率相一致。因此認為NFL可作為只在ALS患者出現或即將出現癥狀時才會顯著增加的標志物。

2.2SOD1 SOD1是一種廣泛表達的抗氧化酶，參與過氧化物轉化為氧和過氧化氫，保護細胞免受氧化應激。近20%的FALS病例是由SOD1基因突變引起的，并已被廣泛研究證實。有研究檢測了ALS患者和對照組之間的腦脊液SOD1水平，但未能發現兩組之間的顯著差異，表明SOD1 腦脊液水平并不能作為ALS的診斷性標志物。但有研究表明，SOD1雖然不是一種診斷性生物標志物，但可作為一種誘導SOD1降低的治療方法的藥效學(PD)生物標志物〔5〕。

2.3C9orf72 C9orf72重復擴增可在包括FALS和額顳葉癡呆(FTLD)等多種神經退行性疾病中檢測到。在ALS和FTLD患者中可檢測到由C9orf72重復擴增翻譯來的5個二肽重復蛋白(DPRs)，且該蛋白已被證實具有誘導神經毒性作用〔6〕。研究還發現DPRs可誘導產生應激顆粒，能限制翻譯起始，是ALS的特征性病理改變之一〔7〕。因此通過檢測C9orf72重復擴增或血和腦脊液中DPRs可作為診斷ALS的重要生物標志物。

2.4TDP-43 TDP-43已被大量研究證實廣泛存在于SALS和FALS的胞質內。TDP-43也是目前被認為是最有價值的ALS生物標志物之一。但由于TDP-43在體液中可能存在產生限制免疫檢測的抗體結構〔8〕，導致目前仍難以作為一種有效的生物標志物用于臨床檢測。

2.5胱抑素(Cystatin)C Cystatin C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，參與細胞外基質(ECM)調控，在ALS背景下，Cystatin C已被確定為一種嗜酸性包涵體——bunina小體的組成部分，而在中樞神經系統中Cystatin C水平的降低也與TDP-43包涵體的形成有關。在一項ALS的縱向研究中，腦脊液中Cystatin C水平隨著時間的推移，快進展和慢進展組的Cystatin C水平分別呈現下降和升高的趨勢〔9〕。而ALS患者血漿中Cystatin C水平卻明顯升高。因此，將Cystatin C作為ALS的生物標志物仍有待進一步研究。

2.6miRNA miRNA通過切割或翻譯抑制來調節基因表達過程，miRNA調控的改變與多種中樞神經系統疾病有關。研究表明在ALS患者脊髓中和攜帶有ALS相關突變基因的脊髓運動神經元中miRNA表達減少，miRNA-1234-3p在SALS患者血清中較健康對照組顯著下降，而在FALS患者血清中與健康對照組無顯著差異〔10〕。提示miRNA-1234-3p可用于SALS的特異性診斷。血漿miRNA-4649-5p在SALS患者中升高，并與病程呈負相關〔11〕。miRNA424和miRNA-206在ALS血漿中的表達明顯高于健康對照組。提示miRNA可能成為一種ALS的潛在的生物標志物。

2.7谷氨酸 谷氨酸興奮性毒性作用是目前公認的運動神經元死亡的病理機制之一，且研究證實在ALS患者腦脊液中存在較高水平的谷氨酸鹽〔12〕。Wuolikainen等〔13〕對SOD1基因突變的ALS患者的腦脊液進行基于質譜的代謝組學研究，發現主要診斷標志物的代謝產物包括精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和焦谷氨酸。而在最近的研究中還發現ALS患者腦脊液和血漿中肌酸水平明顯升高〔14〕，提示肌酸代謝異?？赡芘cALS的發病相關。而在對ALS患者血漿中氨基酸濃度篩選中發現谷氨酸和賴氨酸水平升高，而亮氨酸水平降低，其中谷氨酸水平的升高與病程呈正相關，提示谷氨酸鹽可能作為評估疾病進程的重要代謝標志物。

2.8炎癥介質 通過腦脊液蛋白組學分析研究發現ALS腦脊液中炎癥反應過程主要包括急性炎癥反應和補體激活。如乳酸脫氫酶活性增加提示神經退行性變；幾丁質酶(Chit)-1表達增加提示小膠質細胞激活；血清干擾素水平與疾病進展相關；白細胞介素(IL)-6水平與缺氧嚴重程度相關〔15〕。而在ALS患者血液中發現肌酸激酶、鐵蛋白、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12P70、IL-4、IL-5、IL-10、IL-1明顯升高，而γ干擾素(IFN-γ)明顯下降〔16〕。除了炎癥因子，抗炎因子水平轉化生長因子(TGF)-β1證明與ALS疾病持續時間呈正相關〔17〕。因此各種炎癥介質也成為ALS的潛在標志物。

2.9其他 除了以上常見的ALS的生物標志物，有研究通過檢測尿液發現神經營養素受體p75(p75NTR)、葡萄糖半乳糖基羥基賴氨酸(Glu-Gal Hyl)、Ⅳ型膠原蛋白和8-羥基-2′脫氧鳥苷(8OH2′dG)也被認為是ALS可能的生物標志物，值得進一步研究。而在ALS患者唾液中發現嗜鉻粒蛋白(Chromogranin)A較對照組升高，皮質醇(Cortisol)較正常降低，也被認為是可進一步研究的候選生物標志物。

3 神經肌肉超聲

神經肌肉超聲因其具有無創性、便攜性、直觀性等特點，近年來在ALS的早期診斷、疾病進展評估及觀察治療效果方面得到了越來越廣泛的應用。由于其可對中樞神經系統、周圍神經系統、肌肉系統的結構和功能進行連續的動態評估，彌補了傳統神經電生理檢查的不足〔18〕。

肌肉超聲(MUS)是ALS患者中應用最廣泛的超聲檢查方法。該技術主要通過檢查多個神經節段的肌束顫動、肌肉萎縮和結構變化來篩查與ALS診斷相關的疾病。Misawa等〔19〕研究發現MUS比傳統的肌電圖(EMG)檢查對肌束顫動的檢測敏感性更高，識別率從88%提高到98%。而且MUS為包括顱肌在內的亞臨床區域的下運動神經元功能障礙提供了一種靈敏、可重復的篩查工具。Tamburrini等〔20〕發現通過視頻超聲(VUS) 可對吞咽過程的口腔期進行形態和結構的動態觀察、Nakamori等〔21〕專門研究了ALS患者舌肌厚度的超聲測量；這些都可作為提示球部肌肉上運動神經元損害的標志。MUS還可顯示肢體肌肉結構的形態學變化，特別是通過測量肌肉回聲強度(EI)、回聲變化(EV)和灰度共生矩陣(GLCM)的變化，可以評估疾病的進展程度〔22〕。Arts等〔23〕證明了MUS在區分ALS和模擬疾病中的診斷價值，其敏感性為96%，特異性為84%。

神經超聲(NUS)可通過測量周圍神經的橫截面積(CSA)和頸神經根叢直徑反映下運動神經元損傷導致的神經萎縮〔24〕。但在目前的研究中，尚無法明確周圍神經或神經根CSA與ALS患者臨床嚴重程度、疾病病程或電生理檢查指標間的關系。

雖然神經肌肉超聲在ALS的診斷上具有一定的可行性及優勢，但由于受到機器性能、操作者的熟練程度及目前的研究結果影響，神經肌肉超聲檢查目前僅作為傳統電生理等檢查的一種補充。但隨著對ALS患者神經肌肉超聲研究的進一步深入，越來越多ALS特異性神經肌肉超聲標志物的發現，其在ALS的診斷中所起的作用也將增大。

4 神經電生理

神經電生理檢查主要包括神經傳導測定和針肌電圖檢查，是目前ALS診斷必不可少的檢查之一。神經電生理檢查可提供支持ALS診斷的證據，從而提高診斷的陽性率，縮短診斷延遲時間〔25，26〕。

4.1神經傳導檢測 神經傳導檢測主要包括運動神經傳導檢測、感覺神經傳導檢測和F波檢測。其中運動神經傳導檢測主要包括運動神經傳導速度(MCV)、運動神經遠端潛伏期(DML) 和復合肌肉動作電位波幅(CMAP)。在ALS患者中由于存在肌肉萎縮，常出現CMAP波幅降低或消失。而作為ALS運動神經傳導檢查的特征性表現之一的“分裂手”現象是由于在ALS中可出現拇短展肌和第一骨間肌較小指展肌更早出現肌無力及萎縮，且程度更重，進而在神經傳導檢查中表現為拇短展肌與小指展肌 CMAP 波幅比<0.6 或第一骨間肌與小指展肌 CMAP 波幅比<0.9，其對 ALS 的早期診斷及鑒別診斷具有重要意義〔27〕。Simon等〔28〕研究發現ALS患者下肢也存在腓總神經CMAP波幅低于脛后神經的現象，被稱為“分裂腳”現象。Pinto等〔29〕研究發現胸鎖乳突肌的CMAP波幅降低程度可能是評估ALS患者呼吸功能的一個重要指標。傳統觀念認為ALS僅累計運動神經元，而感覺神經通常不受累。而越來越多的研究證實ALS患者可出現感覺異常，并通過檢查證實感覺神經動作電位潛伏期延長，波幅下降和傳導速度減慢均可出現在ALS患者中，還發現在ALS患者中存在顯著的F波的異常，主要表現為F波的振幅增加和持續時間縮短，而這一現象不僅出現在ALS進展期，也可出現在其他任何時期的ALS患者中〔30〕。除了以上傳統神經電生理標志物，神經生理指數(NI)、運動單位數評估(MUNE)也越來越多的用于ALS的診斷和評估下運動神經元損害的嚴重程度。NI=(CMAP 波幅/遠端運動潛伏期)×F波的頻率，該值的意義在于將神經、肌肉系統作為一個整體對下運動神經元損害進行評估，相較其他指標靈敏度及特異性都更高〔31〕。MUNE是計算神經內全部運動單元的總和，即最大CMAP，然后除以代表該神經中單個運動單元的平均值，從而提供運動單元數的估計值。最近，一種新的MUNE方法MScanFIT MUNE被提出，使用詳細的刺激-響應曲線，或CMAP掃描，提供有關所有運動單元CMAP的信息，與其他MUNE方法相比，具有更好的重復性、運動單元丟失檢測和疾病進展等優點。一項為期15個月的縱向多中心研究強調了運動單元指數(MUNIX)〔32〕作為ALS疾病進展的預測因子具有較好的敏感性和可靠性，并表明MUNIX與各種MUNE技術之間存在顯著的相關性。

4.2針電肌電圖 針電肌電圖是鑒別ALS下運動神經元損害的重要檢查之一，它可在患者出現下運動神經元損害臨床表現或陽性體征前對其進行鑒別，從而為ALS的早期診斷提供支持證據。ALS患者在針電肌電圖檢查中發現正銳波、纖顫電位及束顫電位(FPs) 可提示存在活動期神經源性損害；發現運動單位電位時限增寬、波幅升高及多相波增多可提示慢性神經源性損害。近年來，隨著對FPs的研究深入，發現ALS相關的FPs存在波形不穩定、發放頻率慢的特點，與健康人偶爾可測得的形態單一、時限短、波幅小，波形穩定的良性FPs有顯著差異。FPs對于ALS的診斷上與正銳波、纖顫電位具有同等重要的價值。因此有研究也納入了FPs作為ALS的神經電生理的標志物。需要注意的是，在該研究的診斷標準中提出，針電肌電圖檢測必須在4個解剖區域(延髓、頸隨、胸髓和腰髓)中分別檢測不同神經根及不同周圍神經支配的兩塊或以上肌肉，以明確是否具有廣泛的下運動神經元損害，進而在提高ALS診斷的靈敏度的同時提高診斷特異度〔33〕。

4.3電阻抗肌電圖(EIM) EIM是在檢測肌肉上放置一組4條電極，在2條外部電極之間施加一定高頻電流，在2條內部電極間檢測隨之產生的表面電壓。所測得的表面電壓反映了下層組織的導電和電容特性。這種方法不是產生肌肉纖維興奮，而是提供深部組織的電形態學數據。在對SOD1小鼠的研究表明〔34〕，EIM對疾病進展具有較強的敏感性和高可靠性。同時該技術操作簡便、無創，可對全身大多數淺表肌肉進行檢測。但由于其并非檢測肌肉自發電位，因此常需與針極肌電圖聯合檢測用于ALS的診斷中。

4.4重復電刺激(RNS) RNS檢查是通過低頻或高頻重復刺激神經干后評估神經肌肉接頭功能的一項檢查，常被用于重癥肌無力的診斷。ALS患者也常出現類似于重癥肌無力的RNS出現頻率遞減的現象，其機制可能是由于ALS中下運動神經元損害導致的軸突退化所致。而在頸椎病中RNS多為正常，因此該指標可用于ALS的鑒別診斷。

4.5經顱磁刺激(TMS) TMS是一種通過高強度的交變磁場穿透顱骨進而改變大腦局部皮質興奮性，以評估上運動神經元的功能的一種非創傷性刺激技術。運動閾值(MT)是指能誘發靶肌肉產生動作電位的最小TMS的強度，而研究發現在ALS患者雙側大腦皮層的MT顯著增加，提示皮層運動神經元的減少導致皮層興奮性下降，是上運動神經元損害的直接標志〔35〕。而且有研究發現MT值與總肌萎縮側索硬化功能評分量表(ALS FRS)評分及肌萎縮側索硬化中醫療效評價量表(ALS-SSIT)評分呈負相關，即MT值越高，疾病越嚴重。因此MT值還可作為評估ALS病情進展及嚴重程度的重要標志物〔36〕。中樞運動傳導時間(CMCT)和皮層刺激靜息期(CSP) 在診斷上運動神經元損傷方面也具有較高的敏感性和特異性，在ALS中常表現為CMCT的延長和CSP持續時間的減少或缺失。并且可通過增加檢查肌肉的部位和數量進一步提高CMCT和CSP診斷敏感性和特異性。通過將TMS和功能磁共振成像(MRI)檢查相結合可更全面地評估皮層上運動神經元的功能和損害程度，在ALS的早期診斷和評估中起到越來越重要的作用。

5 神經影像

在ALS病程中隨著神經元的退化，中樞神經系統經歷了巨大的結構變化和細胞水平的變化，而在傳統神經影像中這種變化是難以發現的。隨著多種功能MRI的發展，使得各種分子和細胞層面的中樞神經系統異?？赏ㄟ^影像的方式直觀呈現出來。不僅有助于ALS的早期診斷，還能更好的呈現ALS的病理生理進程。 5.1質子磁共振波譜(H-MRS) 是通過檢測組織中的N-乙酰天冬氨酸(NAA)、膽堿(Cho)、肌酸(Cr)等代謝物濃度，反應神經組織的生化代謝情況，進而發現可能的病理損害的方法。翦凡等〔37〕通過對31例散發型ALS的H-MRS檢測發現ALS患者中央前回皮質下、內囊后肢、大腦腳等沿錐體束走行部位的NAA/Cr和NAA/(Cho+Cr) 較對照組顯著降低，提示該區域神經代謝異常?？勺鳛樵u估上運動神經元的客觀影像標志物。但由于該指標曲下線面積(AUC)為0.67～0.9，其輔助診斷ALS的準確性中等，如需臨床推廣應用仍有待進一步研究。

5.1彌散張量成像(DTI) DTI是通過檢測水擴散局部方向性的差異來評估組織結構的MRI檢查技術。而由于大腦白質纖維束中的水分子與其他腦組織中的自由水分子存在彌散率差異，通過圖像處理技術后可顯示大腦白質纖維的結構和各向異性特征。Chapman等〔38〕研究發現與正常對照組相比，ALS患者DTI檢測可發現廣泛的白質病變，而這些病變與ALS的上運動神經元損害程度呈正相關。進一步DTI研究發現在ALS患者中還存在皮質脊髓束、胼胝體和內囊的后肢、小腦和顳頂葉等諸多局灶性異常改變〔39〕。提示DTI可能是一種潛在的反映ALS疾病進展的標志物。

5.2功能MRI(fMRI) fMRI是通過檢測血流與血氧的改變反映受外界刺激時活化的腦組織區域。ALS患者的皮層重組已被證實，表現為在運動任務期間，對側和同側運動區(包括感覺運動皮層、補充運動區、基底節區和小腦)的激活增加〔40〕。而對側運動區的過度激活可能與疾病進展相關?？v向研究表明，ALS早期由于感覺運動皮質內抑制的喪失導致皮層激活增加，而在疾病中晚期由于運動神經元退化導致皮層激活減少〔41〕。但fMRI作為一種評估ALS病情嚴重程度的標志物仍有待進一步大量縱向研究提供證據支持。

綜上，越來越多的致病基因的發現進一步證實ALS是一種病因復雜累計多系統的神經系統退行性疾病。因此，不可能通過某一種單一診斷標志物對全部ALS進行診斷也逐漸成為一種廣泛的共識。而包括基因檢測、致病蛋白、神經電生理、神經影像等多方面的診斷標志物成為目前ALS診斷的主要研究方向。隨著對ALS疾病病理過程的深入研究，進一步發現更多不僅有助有疾病早期診斷，同時對病情發展、嚴重程度、治療療效判定都相關性的ALS標志物將成為今后研究的重點。