全自動凱氏定氮儀法測定清開靈口服液的總氮量

董麗榮

昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650100

清開靈口服液為臨床常用的清熱解毒類中成藥，具有清熱解毒、化痰通絡、醒腦開竅之功效，主要成分為膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、梔子、水牛角、板藍根、黃芩苷、金銀花[1]。水牛角作為其中的主要原料，具有清熱涼血、解毒、定驚之功效，主要藥效學成分為氨基酸[2-3]，膽酸、豬去氧膽酸為含氮有機化合物。檢驗標準收載于2020版中國藥典一部，原標準采用半微量凱氏定氮法測定總氮量[4]，半微量測定法存在操作及裝置復雜、效率低、重現性差等不足。本實驗采用全自動凱氏定氮儀法測定其總氮量，并對實驗方法進行驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器 全自動凱氏定氮儀 (型號：kjeltec8400)，瑞典FOSS公司生產， 具有凱氏蒸餾和自動滴定功能，最小滴定單位為0.004 mL，可根據滴定缸內溶液顏色變化進行終點判定，分析儀專用消化管體積為250 mL；消化儀(FOSS TecatorTM Digestor2520)，控溫范圍為50～440 ℃；梅特勒萬分之一電子天平(型號：AL204)。

1.2 試藥試劑及材料 五水合硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、氫氧化鈉、95%乙醇、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銨均為分析純。吸收液：取0.1%甲基紅乙醇溶液70 mL，0.1%溴甲酚綠乙醇溶液100 mL， 1%硼酸溶液10 L，混合、搖勻即得。清開林口服液為廣州白云山明興制藥有限公司生產，批號：1201104。

2 方法

2.1 消解 精密吸取清開靈口服液5 mL，加入硫酸鉀∶五水合硫酸銅(9∶1)5 g 混合均勻置于消化管中，加入10 mL濃硫酸，搖勻，靜置半小時。消化時間和溫度(200 ℃：30 min；420 ℃：90 min)，平行制備試劑空白2份。

2.2 儀器準備 先確認冷卻水閥是否打開，再打開主機電源，并進行管路沖洗，確保吸收液、滴定液、稀釋用水為新鮮配置。用所需滴定液潤洗3次滴定器后再充滿滴定器。放入空消化管加水，啟動蒸汽發生器進，運行清洗程序3次。

2.3 儀器回收率實驗 精密稱取硫酸銨粉末0.1 g，平行取樣 6份，加40%氫氧化鈉溶液70 mL，稀釋液(水)30 mL，接收液30 mL，蒸汽發生器功率為90%，測定其回收率。結果見表1。

硫酸銨理論含氮量(%)

平均回收率100.6%，RSD=0.2%。回收率在99%～101%范圍內，RSD≤2%，測定結果的準確性、重復性符合要求。證明該自動凱氏定氮儀性能正常，方法參數設置合理，可進行樣品測定。

2.4 蒸餾和滴定 取消化好的試劑空白和樣品分別上機測定，加40%氫氧化鈉溶液70 mL，稀釋液(水)30 mL，吸收液30 mL，蒸汽發生器功率為90%，硫酸標準滴定濃度為0.05 mol/L。

2.6 參數優化 采用正交設計法優化消解及堿化時硫酸鉀∶硫酸銅(9∶1)、濃硫酸、40%NaoH加入量，選用U6(63)表安排試驗。選擇總氮的含量作為指標，三種試劑加入量作為考察因素A、B、C，選擇6個水平，每個水平各擬一次。均勻設計試驗因素、水平及測定結果見表2。

實驗結果顯示，濃硫酸加入量為10 mL，硫酸鉀∶硫酸銅(9∶1)加入量為5 g，40%NaoH加入量為70 mL時，測得樣品含氮量最高。

3 方法驗證實驗

3.1 精密度實驗 精密吸取清開林口服液5.0 mL，按照優化的凱氏定氮參數條件進行測試，平行測定6次，結果為：2.57 mg/mL、2.55 mg/mL、2.51 mg/mL、2.65 mg/mL、2.65 mg/mL、2.62 mg/mL，平均值為2.57 mg/mL，RSD為2.2%，表明本法精密度良好。

3.2 回收率實驗 精密吸取3.0 mL清開林口服液6份，分別精密加入0.05 g、0.08 g、0.10 g硫酸銨各兩份，按照優選的凱氏定氮測定條件，進行回收率試驗。結果見表3。

表1 儀器回收率實驗結果 (n=6)

表2 均勻設計實驗因素和水平

表3 方法回收率實驗結果 (n=6)

3.3 線性關系實驗 精密吸取清開林口服液2.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL，按照優選的凱氏定氮法測定，以取樣量為(X)橫坐標、總氮量為(Y)縱坐標繪制標準曲線，得線性方程Y=2.534X+0.207，r=0.9995。結果表明，清開林口服液取樣量在2.0～12.0 mL 范圍內與總氮量線性關系良好。

3.4 方法比對實驗 精密吸取清開林口服液3.0 mL，參照藥典方法規定條件，采用半微量凱氏定氮法對樣品中氮含量進行測定，平行測定6份，結果為：2.65 mg/mL、2.50 mg/mL、2.70 mg/mL、2.80 mg/mL、2.45 mg/mL、2.40 mg/mL，平均值為2.58 mg/mL，RSD為6.1%。采用自動定氮儀法，得到的總氮量的平均值為2.6 mg/mL，RSD為2.2%(見3.1)。結果比較顯示，全自動定氮儀法與傳統半微量凱氏定氮法相比，兩種方法的測定結果基本相同，無顯著性差異，但是全自動凱氏定氮儀法組內相對標準偏差即變異系數要小，且精密度更好[6]。

3.5 穩定性實驗 精密吸取清開林口服液5.0 mL，按優化的參數條件進行消解，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h時測定總氮，不同時間點總氮含量的值為2.53 mg/mL、2.62 mg/mL、2.55 mg/mL、2.57 mg/mL、2.64 mg/mL，RSD 為1.8%，表明本法在24 h內穩定性良好。

4 結論

本文建立的自動凱氏定氮儀法測定清開靈口服液中總氮量的方法，從消化到蒸餾、滴定無試樣轉移過程，滴定終點可自動識別，減少了人為因素造成的誤差[7]。具有重復性好、準確度高、快捷、高效的特點。可作為清開靈口服液中總氮量測定的有效方法。

5 討論

凱氏定氮法的原理為：在催化劑(硫酸銅、硫酸鉀)的作用下，樣品中含氮有機物被濃硫酸氧化分解為二氧化碳、水和氨氣，氨氣與硫酸結合生成硫酸銨，再加入強堿溶液，中和消化處理后剩余的濃硫酸，并使(NH4)2SO4轉化為NH4OH，通過加熱蒸餾生成氨氣逸出，被硼酸吸收液吸收，再用一定濃度的硫酸或鹽酸標準溶液進行酸堿滴定，根據所用標準酸的量計算出待測物中的總氮量[8]。硫酸銨要在足夠的堿液中才能使結合態的氨游離出來，所以用到的氫氧化鈉需過量，過量的標志是加入40%的氫氧化鈉后變為棕黑色溶液[9]。過量的氫氧化鈉會與硫酸銅反應生成藍色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅在蒸餾過程中受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。堿加入量不夠會造成測定結果偏低[10]。

硫酸鉀與濃硫酸作用生成硫酸氫鉀可以提高反應體系的溫度，從而提高溶液的沸點以加快反應中有機物的分解。硫酸鉀的取用要適量,否則會使消化體系溫度過高，使已生成的硫酸銨過熱分解而造成氮的損失；硫酸銅除了可以起到催化作用，還可以作為指示劑指示消化終點的到達。使用催化劑的比例需適合,否則會導致消化過程時間過長,以及過量的催化劑與濃硫酸造成資源浪費及環境污染[11-12]。

接受液為1%的硼酸溶液，加入指示劑后正常顏色為酒紅色，存儲過程應避光熱，若使用過程中發現顏色改變，應重新配置。

蒸汽發生器的功率為冬春設置為90%～100%，夏秋設置為80%～90%，功率設置過高測定過程中凱氏定氮儀系統整體過熱，使測量值稍偏離真實值。滴定液消耗量在8～15 mL，含量結果在11.0～15.0 mg內準確性較高。