基于蛋白質組學探討仙連解毒方干預小鼠結直腸癌濕熱瘀毒證模型的作用靶點及信號通路研究＊

陸思丞，程海波＊＊，余成濤＊＊，沈衛星，徐長亮，譚佳妮，賴岳陽，范旻旻

（1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院 南京 210023；2.江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心 南京 210023）

結直腸癌是（colorectal cancer，CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，占全球每年確診癌癥和腫瘤相關死亡人數的近10%[1]，在我國，盡管CRC在診斷、手術治療、靶向治療和免疫治療方面取得了巨大的進步，但由于復發伴遠處轉移和抗腫瘤藥物耐藥，CRC發病率和死亡率依然逐年上升[2]。而中醫藥治療能較好地改善生活質量，減輕藥物不良反應，提高患者免疫功能，延長生存期，具有良好的臨床應用前景。國醫大師周仲瑛教授“癌毒”病機理論認為，腫瘤的核心病機主要是“痰瘀郁毒”[3]，在腫瘤的早期正盛邪虛，癌毒蘊結，形成腫塊，中期以邪勝正傷，晚期以正虛為主，最終步入損途[4]。本團隊認為CRC多屬本虛標實，其主要病理因素為濕、熱、瘀、毒、虛，濕熱瘀毒證是結直腸癌的核心證候[5]，清熱化濕、祛瘀解毒、健脾益氣法是結直腸癌的基本治法，在此治法指導下形成的仙連解毒方（Xian-Lian-Jie-Du Decotion，XLJDD）是岐黃學者程海波教授臨床用于治療CRC濕熱瘀毒證的經驗方，主要組成有仙鶴草、黃連、炙黃芪、生薏苡仁等，但其機制尚不明確。

蛋白質組學通過比較生物體內或者組織內所有蛋白的差異表達，從蛋白分子水平揭示物質基礎和機制，其整體、動態、網絡的特點與中醫整體觀念、中醫辨證論治、中藥復方多靶點多層次等研究方法不謀而合[6]。本文以結直腸癌濕熱瘀毒證小鼠為模型，研究仙連解毒方對結直腸蛋白質組學的影響，從蛋白分子層面探究XLJDD可能的作用機制，從而為仙連解毒方的臨床應用提供重要的科學依據。

1 材料

1.1 動物

選用6周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠90只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006；南京中醫藥大學實驗動物中心倫理審查通過本次動物實驗方案，批準實驗號為201911A027；小鼠在室溫23-25℃，濕度40-70%條件下于南京中醫藥大學實驗動物中心喂養。自由飲水攝食，適應環境1周后開始實驗。

1.2 藥物

仙連解毒方中所有藥材均購自江蘇省中醫院，經南京中醫藥大學鄒立思教授鑒定為道地藥材，符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。

1.3 儀器

Q ExactiveTM HF-X質 譜 儀（Thermo）、EASYnLCTM 1200納升級液相色譜儀（Thermo Fisher/LC140）、低溫離心機（Thermo/Micro CL21R）、冷凍干燥機（Labogene/Scan Speed 40）、電 泳 儀（Bio-Rad/1645050）、渦旋混合器（SCILOGEX/MX-S）、電泳槽（Bio-Rad）、電子天平（Sartorius/BSA124S）、酶標儀（Thermo/SPARK 10M）、制冰機（Scotsman/AF103）、組織研磨儀（上海凈信/24孔）、細胞破碎儀（寧波新芝/JY92-11N）。

1.4 試劑

偶氮甲烷（AOM，Aladdin/A2107153-25 mg）、葡聚糖 硫 酸 鈉（DSS，MPBIO/SR01606-500g）、iRT kit（Biognosys）、Bradford蛋白定量試劑盒（碧云天）、二硫蘇糖醇（DTT，Sigma/D9163-25G）、碘代乙酰胺（IAM，Sigma/I6125-25G）、十二烷基硫酸鈉（SDS，國藥）、尿素（國藥/10023218）、質譜級胰酶（Promega/V5280）、碳酸氫銨（Sigma/5330050050）、液相色譜級超純水（Thermo Fisher Chemical/W6-4）、三乙基碳酸氫銨緩沖液（TEAB，Sigma/T7408-500ML）、液 相 色 譜 級 乙 腈（Thermo/A955-4）、液相色譜級甲酸（Thermo/A117-50）、丙 酮（北 京 化 工 廠/11241203810051）、氨 水（Sigma/221228-500ML-A）、ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒（Bio-Rad/1633007）、三氟乙酸（TFA，Sigma/T6508-100ML）。

2 方法

2.1 藥物制備

XLJDD藥材置于清水中室溫浸泡2 h。分別用10倍（1∶10，w/v）和8倍（1∶8，w/v）蒸餾水煎煮2 h，煎煮2次，抽濾，濃縮至1.2 g·mL-1，60%乙醇水提醇沉24 h，抽濾、旋去乙醇，濃縮至2 g·mL-1。參考臨床常用劑量，根據人與動物給藥等效劑量比公式換算小鼠給藥量為12.9 g·kg-1。

2.2 動物模型分組及給藥

結直腸癌濕熱瘀毒證小鼠模型建立參考文獻方法[7-8]，以AOM/DSS誘導同時予以高糖高脂飼料（20%蛋白、35%碳水化合物、45%脂肪，江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司）喂養的復合方法構建。小鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照（Control）組、模型（Model）組以及仙連解毒方（XLJDD）組，每組30只。Control組小鼠正常飲食，Model組和XLJDD組小鼠予以高脂飼料喂養，小鼠DSS飲水的同時置于造模箱（（33±2）℃，相對濕度（93±2）%），持續8 h，連續7天，每只小鼠每天飲用5 mL的2% DSS溶液，連續飲水14天，此為一個循環，持續三個循環。期間記錄小鼠體重變化，造模過程中會出現明顯體重階段性下降，同時觀察小鼠肛門處出現充血水腫、甚至出現隆起贅生物為模型成功顯著標志。Model組和XLJDD組小鼠腹腔注射AOM（10 mg·kg-1），Control組小鼠注射等體積0.9%氯化鈉溶液。DSS飲水后開始XLJDD組小鼠灌胃，每周6次。

2.3 小鼠結直腸組織蛋白質組學檢測

2.3.1樣品制備

委托北京諾禾致源生物科技有限公司對本次實驗樣品進行蛋白組學測序分析，組織樣品在低溫條件下仔細研磨成粉，置于液氮預冷的離心管中，加入適量PASP蛋白裂解液（100 mmol·L-1碳酸氫銨、8 mol·L-1尿素，pH=8），于冰水中超聲裂解10 min充分震蕩混勻。將樣品置于低溫離心機中，4℃、12 000 g離心15 min，小心吸取上清，加入濃度10 m mol·L-1二硫蘇糖醇于56℃孵育1 h，結束后加入足量碘代乙酰胺，室溫避光孵育1 h。加入4倍體積的-20℃預冷丙酮，在-20℃條件下沉淀時間大于2 h，樣品4℃、12 000 g離心15 min后收集沉淀。之后加入大約1 mL-20℃預冷丙酮重懸沉淀，4℃、12 000g離心15 min，收集沉淀，晾干沉淀，最終根據沉淀體積加入適量蛋白溶解液（8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1TEAB，pH=8.5）溶解蛋白沉淀，上機備用。

2.3.2數據采集

配制流動相A液（100%水、0.1%甲酸）和B液（80%乙腈、0.1%甲酸）。每個樣本取上清4μg，加入iRT試劑0.8μL，之后將每份樣品一分為二上機檢測。使用EASY-nLCTM 1200納升級液相色譜儀系統，自制預柱及自制分析柱規格：（4.5 cm×75μm，3μm），（15 cm×150μm，1.9μm）。本 次 研 究 樣 品 使 用Q ExactiveTM HF-X質譜儀，Nanospray Flex?（ESI）離子源，離子噴霧電壓為2.1 kV，離子傳輸管溫度為320℃，采用非數據依賴型采集模式（DIA），質譜全掃描范圍：m/z 350-1500，一級質譜分辨率：60000（200 m/z），C-trap最大容量：5×105，C-trap最大注入時間：20 ms；二級質譜檢測由高能碰撞裂解方法破碎進行，二級質譜分辨率：30000（200 m/z），C-trap最大容量：1×106，肽段碎裂碰撞能量設為27%。

2.3.3數據分析

使用搜庫軟件Proteome Discoverer 2.2（PD2.2，Thermo）定性蛋白，之后將鑒定結果導入Spectronaut（version 14.0，Biognosys）軟件生成譜圖庫。用T-test檢驗對蛋白質定量結果進行統計分析，實驗組和對照組相比P≤0.05且Fold change≥1.5為上調差異表達，P≤0.05且Fold change≤0.67為下調差異表達。針對差異表達蛋白，使用interproscan軟件進行GO和IPR功能注釋，COG和KEGG進行蛋白家族及通路分析，最后使用STRING DB軟件預測可能的蛋白質-蛋白質相互作用。

3 結果

3.1 小鼠結直腸癌組織蛋白數據質量評價

通過DIA采集各組樣品中的蛋白信息并定量分析，結果顯示樣品中檢測的肽段大小分布在7-25之間（圖1A），并且母離子質量容差分布顯示峰型集中在0附近，表明數據質量偏差小（圖1B），此次鑒定共得到6855個蛋白數量，蛋白覆蓋度分布圖顯示鑒定所得蛋白的覆蓋率均＞1%（圖1C），通過以上質控分析，表明此次實驗鑒定的蛋白結果具有較好的準確性，數據可信度高。

圖1 數據質控情況

3.2 差異蛋白分析

通過設置差異表達倍數（Fold change≥1.5且P≤0.05）或（Fold change≤0.67且P≤0.05）為篩選條件，繪制差異蛋白火山圖，其中分別展示上調前5及下調前5的差異表達蛋白情況（表1和表2）。結果顯示：模型組（Model）與對照組（Control）相比，共有163個蛋白表達上調和104個蛋白表達下調（圖2A）；仙連解毒方組（XLJDD）與Model組相比，共有98個蛋白表達上調和127個蛋白表達下調（圖2B）。同時，在Model組和XLJDD組中都有表達差異的蛋白共有33個。其中差異蛋白在Model組中升高，仙連解毒方干預后下調的蛋白共有18個，分別是：免疫球蛋白kappa4-80（IGKV4-80）、免疫球蛋白重常數3（IGHG3）、免疫球蛋白重變量V1-54（IGHV1-54）、鳥苷酸結合蛋白6（GBP6）、包膜表面糖蛋白（ENV）、TRAF2和NCK相互作 用 激 酶（TNIK）、膠 原 蛋 白XIV阿 爾 法1型（COL14A1）、磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶（PIKFYVE）、酶動力蛋白3（DNM3）、c型凝集素結構域家族2成員d（CLEC2D）、分選連接蛋白7（SNX7）、犰狳重復包含8（ARMC8）、錨蛋白重復序列和鋅指結構域包含1（ANKZF1）、Ig kappa chain V-III region PC 6684、甘露糖乙酰葡糖胺轉移酶（MGAT5）、干擾素伽瑪誘導蛋白47（IFI47）、乙酰轉移酶80（NAA80）和WW包含螺旋適配器結合域（WAC）；在Model組中降低，仙連解毒方干預后上調的蛋白共有12個，主要是后期促進復合亞基5（ANAPC5）、死亡因子4蛋白（MORF4l2）、過氧化物酶體生物發生因子5（PEX5）、UBX結構域蛋白7（UBXN7）、二磷酸果糖酶C蛋白（ALDOC）、腭心面綜合征中缺失犰狳重復基因（ARVCF）、巖藻糖轉移酶4（FUT4）、醣脂類轉運蛋白（GLTP）、溶質載體家族30成員9蛋白（SLC30A9）、凝集素半乳糖結合可溶性蛋白12（LGALS12）、細胞色素C氧化酶組裝因子7（COA7）和泛素氧化還原酶復合裝配因子4（NDUFAF4）。

表1 差異表達蛋白TOP10（Model組VS Control組）

表2 差異表達蛋白TOP10（XLJDD組VS Model組）

圖2 差異蛋白火山圖

3.3 GO分析

將所有獲得的差異蛋白與Gene Ontology數據庫中的條目進行比對，計算每個條目中所占蛋白質數目，找出本實驗中差異蛋白所顯著富集的條目，從細胞組分生物學過程、分子功能、細胞組成3個層次進行GO注釋后富集分析，繪制GO富集柱狀圖。結果顯示：Model組與Control組相比，在生物過程中，差異蛋白主要富集在脂質代謝、小分子生物合成和脂質合成等，在細胞組分中，差異蛋白主要富集在細胞外區域和細胞周圍等，在分子功能中，差異蛋白顯著富集在轉移酶活性、受體結合等（圖3A）；類似地，XLJDD組與Model組相比，在生物過程中，差異蛋白主要富集在染色質組織、多肽信號過程、抗原準備與合成、蛋白-DNA復合物組裝等，在細胞組分中，差異蛋白高度富集在細胞漿膜中，在分子功能中，差異蛋白顯著富集在碳水化合物結合、轉移酶活性、鈣離子通道活性等（圖3B）。

圖3 差異蛋白GO分析富集柱狀圖

3.4 KEGG富集分析

KEGG富集分析是基于KEGG Pathway數據庫（www.kegg.jp/kegepathway.html）以KEGG pathway為單位，將篩選的差異蛋白進行KEGG注釋，通過顯著性富集分析判斷確定差異蛋白參與相關的信號轉導途徑。結果顯示：Model組與Control組相比，差異蛋白富集在補體系統、蛋白消化吸收和細胞色素P450代謝等通路（圖4A），造模后經仙連解毒方干預的通路顯著富集在Th1/Th2細胞分化、Th17細胞分化和細胞衰老等通路（圖4B）。

圖4 差異蛋白KEGG富集氣泡圖

3.5 PPI蛋白網絡分析

進一步利用StringDB數據庫（http://string-db.org/）對富集通路中的差異蛋白互作分析，構建蛋白相互作用網絡圖，發現濕熱瘀毒證結直腸癌發生發展的關鍵節點（圖5A）以及仙連解毒方藥物干預作用的關鍵節點（圖5B）。從蛋白互作網絡分析發現，仙連解毒方影響的差異蛋白互作網絡涉及到離子通道、細胞粘附、能量代謝等生物學進程。PPI分析發現PIKFYVE（D3Z5N5）磷酸肌醇激酶在模型組中顯著上調，仙連解毒方干預后顯著下調，并且與PI4K2A（Q2TBE6）有著相互關系。磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶（PIKFYVE）作為重要的核內體和溶酶體的調節器，調控細胞內環境穩態，而磷脂酰肌醇4-激酶2α（PI4K2A）是一種在細胞內吞作用、高爾基功能、蛋白質分類和膜運輸中起重要作用的脂質，提示仙連解毒方可能通過調節磷酸肌酐干預結直腸癌濕熱瘀毒證。

圖5 差異蛋白互作分析圖

4 討論

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發生發展過程中包括組織學、形態學和遺傳學等多步驟參與[9]。炎癥是CRC的主要誘因之一[10]，國醫大師周仲瑛教授的“癌毒”理論闡明腸癌的基本病機是臟腑功能失調、氣血郁滯，夾雜痰濕、瘀血等多種病理因素，受外感毒邪、飲食、情志等內外因素誘導形成癌毒與痰瘀互相搏結于腸道，形成癌腫。因此確立主要治療原則為“抗癌解毒、化濕泄濁、祛瘀通腑、扶正培本”[11]。在此治則指導下，岐黃學者程海波教授通過長期臨床實踐形成治療晚期結直腸癌濕熱瘀毒證的臨床驗方-仙連解毒方，方中以抗癌解毒為核心，清熱、化濕、祛瘀為重點，健脾益氣為根本。

本文通過AOM/DSS誘導小鼠CRC同時加以高糖高脂飲食構建CRC濕熱瘀毒證小鼠模型，基于DIA的蛋白質組學方法進行質譜數據采集，從蛋白質組學層面探討仙連解毒方干預CRC濕熱瘀毒證的潛在生物學機制。蛋白組學結果顯示仙連解毒方干預后共涉及到225個差異蛋白，富集分析發現仙連解毒方的干預機制主要集中在Th1/Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞衰老和能量代謝等通路。其中，Th1/Th2以及Th17作為T細胞的輔助細胞，參與調控機體的免疫反應。仙連解毒方干預后，KEGG分析顯示Th1/Th2細胞分化以及Th17信號通路均顯著富集。研究顯示Th1/Th2以及Th17與結直腸臨床預后密切相關[12]；在AOM/DSS結直腸小鼠模型中，白藜蘆醇通過改變腸道菌群調控短鏈脂肪酸以顯著降低Th1和Th17細胞數量，從而抑制結直腸癌的發展[13]。GBP6是鳥苷酸結合蛋白家族的一員，介導經典與非經典炎癥激活途徑，誘導自噬和控制囊泡運輸，其甲基化與胃癌復發、TNM分期和生存預測有相關性[14]。結果顯示，在Model組中GBP6表達上調，經仙連解毒方干預后GBP6表達顯著下調，表明其可能是仙連解毒方調控靶點之一。相似地，TNIK激酶也是在Model組中蛋白表達升高后仙連解毒方干預后表達下調，而已有研究報道TINK缺陷小鼠對AOM誘導的結直腸癌具有抗性[15]，而黃連的有效成分藥根堿能靶向TNIK蛋白介導的Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌轉移[16]。MGAT5即N-乙酰葡糖胺基轉移酶5參是一個重要的腫瘤發生和轉移相關酶[17]，上調MGAT5表達導致細胞-細胞和細胞-基質粘附降低，并促進運動和侵襲性[18]，而仙連解毒方能顯著下調其蛋白表達。值得注意的是，PPI蛋白網絡分析篩選出的節點蛋白顯示，PIKFYVE即磷酸肌醇激酶是重要的節點蛋白，其被廣泛報道作為小分子抑制劑靶點發揮腫瘤治療作用[19]，其也被證明能選擇性抑制免疫細胞產生IL-12/IL-23[20]，涉及包括MAPK、WNT、AKT通路等發揮調控細胞自噬、凋亡等生物學進程。

綜上所述，此次研究通過運用蛋白質組學研究方法，通過信息分析技術發現仙連解毒方干預CRC濕熱瘀毒證的差異表達蛋白主要富集在Th1/Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞衰老等重要的生物學途徑，其中GBP6、TNIK、MGAT5、PIKFYVE等蛋白可能是仙連解毒方作用的潛在靶點，可通過炎癥反應、免疫調節等方面發揮治療CRC作用，對臨床治療有重要的指導意義，闡述復方中藥的作用機理。然而，僅通過蛋白質組學的分析結果較為片面，雖然有一些結果與文獻報道相似，但是為了更加全面的分析仙連解毒方對CRC濕熱瘀毒證的作用靶點，我們后續將利用液-質聯用分析技術，轉錄組學、單細胞組學等多組學研究方式結合，并且驗證篩選出的效應蛋白，多角度詮釋仙連解毒方的作用機制。