水稻OsMBF1c基因的克隆及表達分析

石 楊, 汪夢婷, 靳雨璠, 于 月, 張 旭, 李家豪, 姜 南, 李 斌, 陳 稷, 黃 進*

(1. 成都理工大學 生態環境學院, 成都 610059； 2. 四川農業大學 農學院, 成都 611130 )

近年來，隨著人類工業化進程的加快，干旱、鹽堿化和重金屬污染問題對農作物的威脅日趨嚴重，其中重金屬污染問題尤為突出。鎘(Cd)作為一種重金屬，因其具有高毒性，即使在土壤中以較低濃度存在，也會對農作物產生極強的毒性，進而影響農作物的生長發育(Toppi & Gabbrielli, 1999；金楓等，2010)。水稻(Oryzasativa)作為我國重要的糧食作物，其生長發育受到土壤中Cd的嚴重危害(Zheng et al., 2021)。因此，如何改善重金屬對水稻生長發育的影響并解決籽粒中的重金屬積累問題，對未來培育耐Cd水稻品種以及保障糧食生產安全均具有重要意義。目前，水稻應對重金屬脅迫的轉錄調控機制的研究較為廣泛，相關轉錄因子、轉錄調節因子等因對抗脅迫功能基因的表達起著重要調節作用，而一直成為研究熱點。多蛋白橋聯因子1(multi protein bridging factor 1, MBF1)是植物處于生物及非生物脅迫應答過程中起重要作用的轉錄調節因子之一(Wang et al., 2017)。MBF1蛋白主要由N端“MBF1”結構域和C端“α-螺旋-β-轉角-α-螺旋”結構域組成，可通過橋聯轉錄激活因子和TBP(TATA-Binding Protein)調控多種信號轉導途徑并激活多種防御因子，最終提高植物在逆境脅迫下的耐受性(Millership et al., 2004；Jaimes-Miranda & Chvez Montes, 2020)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)、菊花(Chrysanthemummorifolium)中MBF1基因家族可參與調控植物應對熱、氧化和干旱等脅迫反應(Suzuki et al., 2005；Pamela et al., 2010； Zhao et al., 2019)。然而，MBF1是否參與植物應對重金屬脅迫通路，以及是否可能緩解植物因重金屬而引起氧化損傷等的相關研究卻少見報道。此外，對MBF1的研究也僅僅局限于擬南芥、小麥等物種，在水稻中潛在的功能和作用機制的研究則較少，而水稻作為我國重要的糧食作物之一，研究其抗逆機理顯得尤為重要。

本研究對水稻中的MBF1基因家族進行了生物信息學分析，并以水稻為材料，利用PCR方法克隆得到了OsMBF1c(LOC_Os06g39240)基因的全長編碼區(coding sequence, CDS)。在此基礎上，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法對Cd處理下不同水稻組織中OsMBF1c的相對表達量進行分析。旨在探究以下問題：(1)水稻MBF1蛋白家族親緣進化關系、理化性質以及結構特征；(2)水稻MBF1基因家族成員在Cd脅迫下的表達變化情況；(3)水稻MBF1在緩解Cd危害過程中的潛在功能。本研究結果將為耐鎘水稻品種的培育提供潛在的基因資源，同時為進一步解析該基因在水稻中應對重金屬脅迫的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子于4 ℃保存。選健康種子放入適量無菌水中，30 ℃催芽48 h。將發芽種子置于1/2 MS液體培養基中，30 ℃溫室進行光照16 h/黑暗8 h交替培養，5 d后選取同一生長階段的幼苗進行CdCl2(100 μmol·L-1)脅迫處理，經時間梯度(1、6、12 h)處理后采集地上部分和根部，并將其立即用液氮進行速凍，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 OsMBF1c基因克隆

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 將CdCl2處理的水稻組織參照Aidlab公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒的說明書進行總RNA的提取。提取成功后，取1 000 ng RNA，參照ThermoFisher公司Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2OsMBF1c基因的克隆和測序 根據水稻OsMBF1c基因的CDS序列設計引物OsMBF1c-F/OsMBF1c-R(表1)。以水稻cDNA為模板，使用擎科生物科技有限公司的金牌Mix酶對OsMBF1c基因的CDS序列進行PCR擴增。利用膠回收試劑盒對PCR產物進行膠回收后，利用Vazyme公司的ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒連入pGADT7載體，并轉化至大腸桿菌DH5α菌株。挑取陽性克隆培養后，使用天根生化科技公司的質粒小提試劑盒提取重組質粒并進行酶切驗證，送往擎科生物科技有限公司(成都)進行測序。

表 1 基因克隆和表達檢測引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression analysis

1.3 生物信息學分析

從EnsemblPlants數據庫(http://plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)獲得水稻、大麥(Hordeumvulgare)、二粒小麥(Triticumdicocoides)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)的整個基因組以及gff3注釋文件，使用TBtools軟件將整個基因組序列翻譯為蛋白序列。利用OsMBF1c的氨基酸序列在Pfam(http://pfam.xfam.org/)網站中對其編碼蛋白的結構域進行分析，目的基因編碼蛋白中含有與非生物脅迫相關的MBF1結構域，先通過Pfam網站得到其HMM結構模型，再通過TBtools軟件的Simple HMM Search功能對水稻、二粒小麥、大麥、高粱和玉米的蛋白序列進行分析，篩選確定所選物種中的MBF1基因家族成員。

利用在線ProtParam工具(https://web.expasy.org/protscale/)對OsMBF1c的基本理化性質進行預測和分析；利用SCOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)對蛋白質二級結構進行預測；利用水稻OsMBF1c基因編號在Rice Genome Annotation Project網站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)獲得啟動子序列；通過The PlantCARE網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子順式作用元件，采用TBtools軟件制圖。

利用在線Multalin軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)對其編碼的氨基酸序列進行比對；利用MEGA 7.0軟件中Neighbor-joining法構建系統進化樹；通過The MEME Suite網站(https://meme-suite.org/meme/index.html)對其同源蛋白進行motif分析，利用TBtools中的Visualize Motif Pattern功能對多序列的motif元件進行分析與美化。用STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)，對水稻OsMBF1c蛋白的相互作用進行預測。

1.4 OsMBF1c基因表達分析

以稀釋20倍的Cd處理水稻的cDNA為模板。采用德國耶拿分析儀器股份公司(Analytikjena)qTOWER3G 實時熒光定量基因擴增儀檢測OsMBF1c、OsMBF1a基因的表達量。反應試劑采用Aidlab的2 × Sybr Green qPCR Mix。擴增體系為cDNA 3 μL、SYBR Green 5 μL、引物(2.5 μmol·L-1)各1 μL。反應程序：95 ℃預變性2 min； 95 ℃變性15 s， 55 ℃復性15 s， 72 ℃延伸20 s， 72 ℃后延伸3 min，40個循環。以水稻Ubiquitin作為內參基因。每個樣品均設置3次重復，以2-ΔΔCt方法分析定量數據。

1.5 數據統計分析

使用Graphpad軟件對不同處理Cd濃度、不同處理時間、不同組織的數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 水稻OsMBF1c基因結構分析及CDS全長克隆

利用Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查詢得知，基因OsMBF1c位于水稻全基因組的第六號染色體上，OsMBF1c基因CDS長度為468 bp(圖1：A)?；谒綾DNA文庫，使用OsMBF1c-F/OsMBF1c-R引物擴增OsMBF1c基因CDS片段, 獲得大小約為468 bp的目的基因，其共編碼155個氨基酸。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的PCR產物，條帶大小(圖1：B)與基因組數據庫結果一致。

A. OsMBF1c 基因結構分析; B. OsMBF1c CDS擴增產物; M. DL2 000 標記; L. OsMBF1c基因CDS擴增產物。A. Structure analysis of OsMBF1c gene; B. OsMBF1c CDS amplification product; M. DL2 000 Marker; L. CDS amplification product of OsMBF1c gene.圖 1 OsMBF1c基因結構分析及CDS全長擴增產物Fig. 1 Gene structure analysis of OsMBF1c and amplification product of OsMBF1c CDS

2.2 水稻OsMBF1c基因的生物信息學分析

使用ProtParam工具預測分析OsMBF1c蛋白的基本理化性質。結果顯示，OsMBF1c蛋白含有155個氨基酸，分子式為C698H1184N224O209S3，分子量為16.154 kDa，理論等電點(PI)為10.67，表明此蛋白質呈堿性；蛋白質不穩定性指數37.59，表現為穩定蛋白；進一步在Expasy網站上利用ProtScale軟件對OsMBF1c蛋白親/疏水性進行分析，結果顯示，OsMBF1c蛋白多肽鏈的第24位分值最低，為-2.111；第126位分值最高，為1.856，同時OsMBF1c親水區域大于疏水區域，屬于親水性蛋白(圖2：A)；二級結構預測發現(圖2：B)，在OsMBF1c氨基酸組成中，以無規則卷曲為主，占46.45%，其次為α-螺旋，占45.16%，β轉角占比最少，為4.52%。

A. 疏水性區域預測; B. 二級結構預測。藍色. α-螺旋; 紅色. 延伸鏈; 綠色. β-轉角; 紫色. 無規則卷曲。A. Hydrophobic region prediction; B. Secondary structure prediction. Blue. α-helix; Red. Extended chain; Green. β- corner; Purple. Random coil.圖 2 OsMBF1c蛋白的生物信息學分析Fig. 2 Bioinformatics analysis of OsMBF1c protein

2.3 水稻OsMBF1c基因啟動子順式作用元件分析

通過TBtools對OsMBF1c順式作用元件進行可視化分析，結果如圖3所示。OsMBF1c的啟動子序列中含有參與調節厭氧感應的順式作用元件ARE、GC-motif、光響應元件G-box、乙烯響應元件ERE等。這些順式作用元件可能在水稻應對不同非生物脅迫響應機制中對啟動子的調控發揮重要作用，其啟動子中基序的存在說明該基因有可能參與不同類型非生物脅迫的應對機制。

圖 3 OsMBF1c蛋白的順式作用元件分析Fig. 3 Cis-acting element analysis of OsMBF1c protein

2.4 水稻OsMBF1c多重序列比對和同源性分析

將OsMBF1c氨基酸序列與水稻、大麥、小麥、高粱和玉米等5種禾本科常見物種中同源基因的氨基酸序列進行同源性分析 (圖4)。結果顯示OsMBF1c與這些植物的MBF1氨基酸序列同源性介于41.29%～98.59%之間。其中，水稻OsMBF1c與二粒小麥TdMBF1a.1的同源性最高，而與玉米ZmEDRF 1.1的同源性最低。為進一步了解OsMBF1c與其他植物的MBF1蛋白之間的進化關系，利用 MEGA 7.0的Neighbor-Joining方法構建系統進化樹(圖5)進行分析，結果顯示OsMBF1c與二粒小麥TdMBF1c.1、TdMBF1c.2、大麥HvMBF1.1的親緣關系最近，該結果與基因同源性比對結果相一致。

2.5 MBF1同源蛋白保守基序分析

利用MEME對17條不同物種中MBF1蛋白進行了保守基序分析(圖6)，共鑒定獲得10個保守基序(motif)。除ZmMBF1a外，其他同源蛋白的motif分布相對均勻，其分布數量與位置也基本相同，且在MBF1的同源蛋白中均存在motif 1與motif 2，這說明此蛋白質在進化過程中具有高度保守性，進而推斷OsMBF1c可能與其他物種中的MBF1具有相同的功能特性。

2.6 水稻MBF1基因家族表達特性分析

分析了OsMBF1a、OsMBF1c在水稻進行100 μmol·L-1Cd處理下的表達情況。結果顯示，在100 μmol·L-1Cd 處理下，地上部分OsMBF1a、OsMBF1c基因的表達水平均表現為上調，其中OsMBF1c在1 h達最高點，約為對照組(0 h)的7倍；隨后呈下降趨勢，處理6 h的基因相對表達量約為對照組的5.5倍，處理12 h的基因相對表達量變為對照組的3.5倍(圖7：A)；OsMBF1a基因表達量在6 h達最高點，約為對照組(0 h)的4.2倍，而在12 h時基因表達量呈下降趨勢，約為對照組(0 h)的0.2倍(圖 7：B)；根部OsMBF1a、OsMBF1c基因的相對表達量較地上部分變化幅度較小，而與對照相比，個別處理時間呈顯著性差異。結果還顯示，100 μmol·L-1Cd 處理下，根部OsMBF1c基因在6 h達最高點，約為對照(0 h)的3倍(圖8：A)，根部OsMBF1a基因在12 h達最高點，約為對照(0 h)的4.4倍(圖 8：B)。

A. 水稻OsMBF1c基因的表達分析； B. 水稻OsMBF1a基因的表達分析； **. 與對照差異顯著(P<0.01); ***. 與對照差異極顯著(P<0.001)。下同。A． OsMBF1c gene expression analysis of rice； B. OsMBF1a gene expression analysis of rice; **. Significant difference compared with control (P<0.01); ***. Extremely significant difference compared with control (P<0.001). The same below.圖 7 100 μmol·L-1 Cd脅迫水稻地上部分中OsMBF1c、OsMBF1a基因的相對表達量變化Fig. 7 Relative gene expression changes of OsMBF1c and OsMBF1a from the shoot of rice treated under 100 μmol·L-1 Cd stress

A. 水稻OsMBF1c基因的表達分析。B. 水稻OsMBF1a基因的表達分析。A. OsMBF1c gene expression analysis of rice; B. OsMBF1a gene expression analysis of rice.圖 8 100 μmol·L-1 Cd脅迫水稻根部中OsMBF1c、OsMBF1a基因的相對表達量變化Fig. 8 Relative gene expression changes of OsMBF1c and OsMBF1a from the root of rice treated under 100 μmol·L-1 Cd stress

2.7 OsMBF1c蛋白互作網絡分析

利用STRING數據庫構建了水稻OsMBF1c蛋白的蛋白互作網絡圖(圖9)。結果顯示，OsMBF1c蛋白與OsRRM、HSFA6A和HSFA6B具有較強的相關性，其中HSFA6A、HSFA6B在植物應對高溫、干旱和重金屬等多種非生物脅迫過程中起著重要作用。通過預測與OsMBF1c蛋白互作的靶蛋白，將更加有助于深入探究水稻OsMBF1c蛋白的功能和調控機理。

圖 9 水稻中OsMBF1c蛋白相互作用網絡Fig. 9 Protein interaction network of OsMBF1c in rice

3 討論與結論

水稻在生長發育過程中可能會受到鹽、低溫、干旱、重金屬等各種逆境脅迫，其中重金屬所產生的危害嚴重制約著水稻產量和品質。水稻在長期進化過程中，逐漸形成了一套復雜的網絡調控機制，以應對重金屬逆境脅迫(董蔚等，2018)。MBF1蛋白作為轉錄共激活因子，參與植物中各種發育過程和非生物脅迫反應(Jaimes-Miranda & Chvez Montes, 2020)。植物中MBF1研究較多的是模式植物擬南芥，在擬南芥中具有3個MBF1基因，即AtMBF1a、AtMBF1b和AtMBF1c，其中AtMBF1a、AtMBF1c可增強擬南芥對熱、滲透和鹽等非生物脅迫的耐受性(Suzuki et al., 2005；Kim et al., 2007)。Zhang等(2019)研究表明，水稻中存在2個MBF1家族基因，即OsMBF1a、OsMBF1c，這與該文利用生物信息技術篩選出的結果一致，而對該家族基因在重金屬脅迫下的功能研究卻較少。OsMBF1c的基因結構中含有1個外顯子，與擬南芥AtMBF1c相同。而OsMBF1c的同源基因OsMBF1a包含4個外顯子，也與擬南芥AtMBF1a、AtMBF1b的外顯子數相同(Tsuda & Yamazaki, 2004)。本研究結果進一步表明MBF1在不同植物物種間進化具有保守性，但在同一物種內的MBF1a/b與MBF1c卻有較大差異。該現象表明植物在進化壓力的選擇下，就MBF1基因家族整體而言保持了較強的保守性，但該家族成員之間這種保守的差異卻暗示著MBF1c可能與MBF1a/b分別具有不同的生物學功能。此外，對水稻OsMBF1c基因啟動子順式作用元件分析表明，該基因啟動子中包括激素、低溫等逆境應激元件，由此可推測水稻在重金屬脅迫下，該基因可能發揮防御和應激作用。此外，系統進化樹結果顯示，OsMBF1a、OsMBF1c分別與大麥HvMBF1.2、HvMBF1.1親緣關系較近。目前，雖無HvMBF1.1、HvMBF1.2基因功能的相關報道，但在Lai等(2020) 研究發現，大麥中的MBF1可能受脫落酸影響，并激活參與降低ROS含量的基因。由于重金屬脅迫可使植物產生ROS，因此水稻MBF1蛋白是否與大麥MBF1蛋白家族具有相似功能，通過降低水稻ROS含量來提高水稻重金屬耐受性仍需進一步探究。

前人在研究擬南芥、大麥草(Hordeumbrevisubulatum)等植物中MBF1應對非生物脅迫中的作用時發現，MBF1基因的表達模式與其功能有明顯的相關性。例如，Zhang等(2020) 研究發現，經350 mmol·L-1NaCl處理6 h后的大麥草中HbMBF1a基因相對表達量有明顯上調，經過表達HbMBF1a基因的擬南芥也同時呈現出較強的耐鹽性。本研究發現，Cd脅迫可以顯著誘導水稻各器官中OsMBF1c、OsMBF1a基因的上調表達，并在水稻根部和地上部分中對脅迫的響應模式不同，該結果與Zhang等(2020)對鹽脅迫下HbMBF1a表達情況相類似。同時，通過對比地上和地下部分的表達模式發現，在不同Cd處理時間表達情況呈細微差異，在地上部分組織中，OsMBF1c普遍呈上調趨勢，而OsMBF1a在Cd脅迫處理12 h后表達量卻顯著降低；在根部，OsMBF1c在6 h表達達到最高、而OsMBF1a在12 h達到最高，推測OsMBF1c可能參與水稻早期地上組織應對重金屬脅迫的調控機制，而OsMBF1a更多地參與水稻后期根部Cd解毒機制。

目前，尚未有研究證明MBF1蛋白通過何種分子機制對非生物脅迫做出反應，進而調節應激反應。但是，可以推測的是MBF1作為轉錄輔因子，當細胞從非應激狀態到應激狀態，較為靈活的N端結構域可與不同的脅迫應答基因結合，從而一起參與調控植物的應激反應(Millership et al., 2004)。本研究蛋白互作預測顯示，OsMBF1c蛋白與OsRRM、HSFA6A和HSFA6B等蛋白的相關性較強，這些蛋白在植物干旱、熱激和鹽等脅迫方面有著重要意義(Norbert et al., 2021)。在水稻中，OsMBF1c是否可與這些蛋白共同調控重金屬應激反應以及通過何種分子機制對重金屬應激做出反應等問題仍需進一步探究。