半胱氨酸蛋白酶抑制劑C對(duì)胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移的影響

劉 浩，劉 文，向 輝，劉永輝，尚國臣，唐 明

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，新疆 石河子 832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院功能科，新疆 石河子 832008；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師總醫(yī)院圖木舒克院區(qū)消化科，新疆 圖木舒克 843800)

胃癌是威脅人類健康的重大疾病之一，其死亡率和發(fā)病率分別位居所有癌癥中的第二位和第三位[1-2]，且近年來發(fā)病率有上升趨勢(shì)[3]，目前胃癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是胃鏡檢查和病理活檢，但受限于人們對(duì)于胃鏡的接受程度及檢查費(fèi)用偏高，胃鏡檢查目前仍未能成為胃癌大規(guī)模篩查的方法，因此，尋找適宜的胃癌血清學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于胃癌的篩查是有必要的。癌胚抗原(CEA)是目前消化道腫瘤常用的標(biāo)記物，在胃癌的診斷中有著一定的診斷價(jià)值。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，研究表明其在炎性反應(yīng)和腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用[4-5]。本研究通過測(cè)定Cys C在胃癌患者血清中的水平及組織中的表達(dá)并進(jìn)行比較，進(jìn)而評(píng)估其在胃癌診斷中的價(jià)值及在侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用，進(jìn)而尋找胃癌診斷新的血清學(xué)標(biāo)志物，也為胃癌的治療提供新的思路和途徑。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象：選取2019年6月～2021年6月就診于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院早期胃癌患者40例納入早期胃癌組，進(jìn)展期胃癌患者40例納入進(jìn)展胃癌組；另選取同期就診于本院的慢性胃炎患者40例作為正常組；進(jìn)展期胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)電子胃鏡及病理明確診斷為胃癌，術(shù)后病理證實(shí)腫瘤侵犯固有肌層以上；早期胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)為內(nèi)鏡下粘膜剝離術(shù)后及外科術(shù)后病理證實(shí)腫瘤局限于黏膜層及黏膜下層，無論病灶大小及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。正常組男20例，女20例；年齡27～74歲，平均(56.67±11.50)歲；早期胃癌組男26例，女14例；年齡44～83歲，平均(61.15±12.04)歲；進(jìn)展胃癌組男24例，女16例；年齡47～90歲，平均(64.18±11.06)歲。三組研究對(duì)象在性別、年齡、抽煙和飲酒比例、高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)病患病比例上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

表1 三組患者一般情況比較[n(%)，n=40]

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者病史資料完整，均為首次診斷胃癌及早期胃癌，針對(duì)腫瘤未接受任何治療；腎小球?yàn)V過率異常患者予以排除。

1.3檢測(cè)試劑及方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清Cys C 、CEA水平：采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ訣LISA法完成Cys C 、CEA的檢測(cè)，所用酶標(biāo)儀為DNM-9606型，相關(guān)操作遵循試劑盒說明書完成，相關(guān)試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。分析各組 CEA、Cys C表達(dá)水平。

1.3.2免疫組化法檢測(cè)組織中Cys C表達(dá)：分別取正常胃組織、早期癌胃組織、進(jìn)展期癌胃組織及進(jìn)展期癌癌旁組織置于10% 甲醛溶液中固定，進(jìn)展期癌旁組織為距癌組織邊緣2 cm的組織。石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min。枸櫞酸修復(fù)液微波爐中高火修復(fù)至冒泡后再低火修復(fù)20 min，冷卻至室溫，加Cys C一抗，置于4℃冰箱過夜。次日PBS沖洗5 min ×3次，滴加二抗(兩步法)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Cys C主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)弱。每張標(biāo)本切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野區(qū)域計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性表達(dá)率，陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。主要儀器:RM2135型石蠟切片機(jī)，德國LEICA公司;免疫組化圖像分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS株式會(huì)社。主要試劑:兔抗人Cys C多克隆一抗，英國Abcam公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)。CEA與Cys C的檢測(cè)胃癌的效能通過受試者工作特征(ROC曲線)分析。

2 結(jié)果

2.1三組患者血清中CEA與Cys C水平比較：三組患者血清中CEA與Cys C呈遞增趨勢(shì)，各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組患者血清CEA與Cys C水平比較

2.2Cys C與CEA檢測(cè)胃癌ROC曲線分析：?jiǎn)为?dú)CEA檢測(cè)靈敏度63.75%，特異度80.00%，單獨(dú)Cys C檢測(cè)靈敏度87.50%，特異度62.50%，Cys C與CEA檢測(cè)胃癌ROC曲線下面積相近(0.795 vs 0.753)，有著相同的診斷價(jià)值。見圖1。

圖1 CEA與Cys C檢測(cè)胃癌ROC曲線

2.3Cys C在正常及不同分期癌組織中的表達(dá)：Cys C陽性反應(yīng)物表達(dá)位于胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色，在正常組織[7.50%(3/40)]及癌旁組織[37.50%(15/40)]中表達(dá)較弱，在早期癌[22.50%(9/40)]及進(jìn)展期癌[67.50%(27/40)]組織中表達(dá)較正常組織增強(qiáng)，且進(jìn)展期癌中表達(dá)較早期癌增強(qiáng)，進(jìn)展期癌組織中的表達(dá)高于進(jìn)展期癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 Cys C在正常及不同分期癌組織中的表達(dá)(DAB，×200)

3 討論

Cys C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，是一種從血清中分離出來的新型半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在人體大部分組織中穩(wěn)定表達(dá)，并且不受年齡、性別等因素的影響，臨床上常用來評(píng)估早期腎功能損傷及肺動(dòng)脈高壓程度[6-7]，近年來也有研究發(fā)現(xiàn)Cys C在腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[8]。

本研究結(jié)果顯示，Cys C在診斷胃癌方面與CEA有著相同的診斷價(jià)值，且其敏感性高于CEA，用于腫瘤的篩查更具有優(yōu)勢(shì)，而其特異度卻較CEA偏低，提示需聯(lián)合其他指標(biāo)檢測(cè)提高其診斷能力。既往關(guān)于Cys C在腫瘤患者血清中的水平結(jié)果表明，Cys C在食管癌[9]、乳腺癌[10]、 腎細(xì)胞癌[11]、前列腺癌[12]、多發(fā)性骨髓瘤[13]、肺癌[14]、卵巢癌[15]患者血清中水平增高，而在眼部腫瘤患者血清中其水平較正常者低[16]，提示Cys C可能在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中其發(fā)揮作用的機(jī)制不同，進(jìn)而血清中CysC的變化趨勢(shì)不同，但總體來說，腫瘤患者與正常患者血清中Cys C的水平是存在差異的，提示Cys C參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

作為一種存在于組織內(nèi)的蛋白酶抑制劑，Cys C是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)組織蛋白酶B抑制作用最強(qiáng)的抑制物，而組織酶B是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成等過程中起重要作用的蛋白酶[17]。因此Cys C 的一個(gè)生理學(xué)功能可能是調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶的活性,進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。有研究表明，Cys C可能通過調(diào)節(jié)組織蛋白酶B的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)組織蛋白酶B對(duì)組織和細(xì)胞的水解作用，進(jìn)而使得癌細(xì)胞向深層組織浸潤(rùn)發(fā)展[18]。直接浸潤(rùn)蔓延是胃癌的轉(zhuǎn)移方式之一，本研究結(jié)果表明Cys C可能參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究表明，Cys C在結(jié)直腸癌患者血清中水平增高，在癌組織中的陽性率也顯著高于癌旁組織，提示Cys C在結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[19]。另一項(xiàng)關(guān)于Cys C在卵巢癌組織中表達(dá)的研究表明，Cys C在癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且可能通過組織蛋白酶B的表達(dá)來參與卵巢癌的發(fā)生[18]。

綜上所述，Cys C在胃癌患者血清及組織中較正常者存在差異性表達(dá)，對(duì)胃癌的診斷具有一定的意義。不同分期胃癌患者Cys C的差異性表達(dá)，也提示Cys C可能參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。