微RNAs在脊髓缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

劉智明，宗 緣，章 鼎，尹 飛

吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院脊柱外科，長春 130033

脊髓缺血再灌注損傷（SCII）是胸、腹主動脈術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，甚至癱瘓［1］。SCII主要包括缺血和再灌注2個階段，缺血發(fā)生在體內(nèi)大動脈阻斷或循環(huán)停止期間，再灌注包括活性氧和炎性細(xì)胞因子的釋放以及細(xì)胞凋亡［2］。SCII的具體發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚，近年來，對SCII的病因和發(fā)生機(jī)制的研究主要包括氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷、炎性反應(yīng)［3-5］、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載［6-7］、以谷氨酸鹽為主的興奮性氨基酸的毒性作用［8］、細(xì)胞凋亡［9-10］和細(xì)胞自噬［11-12］等。微RNA（miRNA）是一類長度為19 ~ 25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，可以通過和其靶mRNA的3’非編碼區(qū)（3’-UTR）上的互補(bǔ)核苷酸配對來抑制mRNA或蛋白質(zhì)的合成，調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡［13］。靶基因的抑制或降解主要取決于miRNA與其靶基因的互補(bǔ)程度，如miRNA與目標(biāo)mRNA部分配對，會抑制蛋白質(zhì)合成；如miRNA與其靶mRNA完美（或接近完美）配對，則會導(dǎo)致mRNA降解。單個miRNA可以靶向數(shù)百個mRNA，并影響許多基因的表達(dá)。據(jù)統(tǒng)計，miRNAs能夠調(diào)節(jié)人類基因組中多達(dá)30%的編碼基因［14］。此外，miRNAs的作用機(jī)制涉及多種重要過程，包括凋亡、分化、發(fā)育、增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。miRNAs已被證實(shí)與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，包括自身免疫性疾病（如哮喘、嗜酸性食管炎、過敏性鼻炎和濕疹）［15］、癌癥［16］、糖尿病及心血管疾病［17-18］、骨骼肌肉疾病［19］。miRNAs因在細(xì)胞液中的穩(wěn)定性、在人類和哺乳動物之間的保守性和組織特異性成為重要的生物標(biāo)志物，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病（包括SCII）中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［20-21］。

有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與了SCII的發(fā)生，并通過不同的作用機(jī)制對SCII產(chǎn)生不同的影響。其中有些miRNA在SCII發(fā)生后表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)SCII的發(fā)生和發(fā)展，被稱作負(fù)性調(diào)控miRNA，包括miR-372，miR-124、miR-204、miR-30c和miR-448［22-26］；有些miRNA在SCII發(fā)生后表達(dá)下調(diào)，抑制SCII的發(fā)生和發(fā)展，被稱作正性調(diào)控miRNA，包括miR-22-3p、miR-199a-5p、miR-129-5p、miR-27a、miR-186-5p、miR-221和miR-497［27-33］。本文查閱了近年國內(nèi)外miRNA對SCII影響的相關(guān)研究，分析不同miRNA對SCII的正向和負(fù)向調(diào)控作用，為治療SCII提供新思路。

1 負(fù)性調(diào)控miRNAs

1.1 miR-372

Li等［22］建立大鼠SCII模型，取脊髓組織觀察發(fā)現(xiàn)，SCII模型組大鼠脊髓組織miR-372水平明顯升高，Beclin-1蛋白水平降低；采用miR-372抑制劑轉(zhuǎn)染SCII細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，促凋亡調(diào)節(jié)因子Bax的蛋白水平降低。采用雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)研究miR-372與Beclin-1的關(guān)系，結(jié)果表明，miR-372抑制了損傷細(xì)胞Beclin-1的熒光素酶活性，miR-372抑制劑則增強(qiáng)了Beclin-1的熒光素酶活性，即miR-372負(fù)調(diào)控Beclin-1表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)了miR-372抑制劑對動物模型的保護(hù)作用，在大鼠SCII模型脊髓損傷區(qū)注射miR-372抑制劑，結(jié)果顯示，與對照組相比，注射miR-372抑制劑能更好地促進(jìn)SCII大鼠的運(yùn)動功能恢復(fù)。綜上，miR-372抑制劑可通過上調(diào)Beclin-1減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1.2 miR-124

Liu等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，SCII組脊髓組織中miR-124的表達(dá)略有提高，轉(zhuǎn)染miR-124反義寡核苷酸（antagomiR-124）后miRNA-124和p53的表達(dá)顯著降低，而細(xì)胞有絲分裂標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)增高。具體表現(xiàn)為，與對照組比較，anagomiR-124轉(zhuǎn)染組SCII發(fā)生6、12、24和48 h后的運(yùn)動缺陷指數(shù)（MDI）明顯降低，大鼠腰段脊髓運(yùn)動神經(jīng)元增加，凋亡細(xì)胞減少。綜上，抑制miRNA-124對SCII的抑制作用，可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂和抗細(xì)胞凋亡作用實(shí)現(xiàn)的。

1.3 miR-204

Yan等［24］的研究發(fā)現(xiàn)，SCII發(fā)生6、12和24 h后，miR-204的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值和Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)。與對照組相比，鞘內(nèi)注射antagomiR-204可顯著抑制缺血后脊髓miR-204和caspase-3的表達(dá)，顯著上調(diào)Beclin-1、Bcl-2的表達(dá)以及LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值。此外，鞘內(nèi)注射antagomiR-204顯著降低SCII發(fā)生6、12、24和48 h后的MDI，增加神經(jīng)元數(shù)量，減少神經(jīng)元凋亡。綜上，抑制miR-204對SCII的抑制作用，可能是通過促進(jìn)細(xì)胞自噬和抗細(xì)胞凋亡作用實(shí)現(xiàn)的。

1.4 miR-30c

Wang等［25］通過大鼠SCII模型和P12細(xì)胞氧糖剝奪（OGD）模型研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，SCII后miR-30c的表達(dá)上調(diào)，SIRT1的表達(dá)下調(diào)，具體表現(xiàn)為Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分降低，P12細(xì)胞凋亡增加，白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)增加。miR-30c基因敲除組與假手術(shù)組相比，大鼠血清和脊髓組織中IL-6和TNF-α蛋白和mRNA水平大幅降低。與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-30c的PC12 OGD細(xì)胞模型中SIRT1的熒光素酶活性顯著下降；在轉(zhuǎn)染了抗miR-30c的 PC12 OGD模型中 IL-6表達(dá)水平降低，說明下調(diào)miR-30c基因表達(dá)可以通過SIRT1途徑來抑制大鼠SCII，還可減少OGD處理后PC12細(xì)胞的凋亡和炎性反應(yīng)。綜上，miR-30c可能是SCII的致病因素之一，也是判斷SCII預(yù)后的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

1.5 miR-448

Wang等［26］的研究發(fā)現(xiàn)，miR-448在SCII組織中表達(dá)顯著增加，SIRT1表達(dá)顯著降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，PC12細(xì)胞經(jīng)過缺氧處理后miR-448表達(dá)上調(diào)，SIRT1表達(dá)明顯下調(diào)。而miR-448抑制劑通過上調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能，緩解SCII。

2 正性調(diào)控miRNAs

2.1 miR-22-3p

Fang等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，SCII發(fā)生12 h后，miR-22-3p表達(dá)明顯下調(diào)，干擾素調(diào)節(jié)因子5（IRF5）表達(dá)上調(diào)。雙熒光素酶報告基因檢測表明IRF5是miR-22-3p的靶基因，可以被miR-22-3p負(fù)調(diào)控。過表達(dá)miR-22-3p或沉默IRF5可減輕脊髓組織的炎性反應(yīng)，提高Tarlov評分，減輕SCII的程度。有研究［28］發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是SCII重要的效應(yīng)細(xì)胞，SCII脊髓組織來源的巨噬細(xì)胞中IRF5的表達(dá)顯著提高，上調(diào)miR-22-3p表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化，并通過抑制IRF5抑制組織炎性反應(yīng)，從而減輕脊髓SCII。綜上，上調(diào)miR-22-3p表達(dá)可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)IRF5的表達(dá)，從而抑制SCII的發(fā)展，為治療SCII提供了新的靶點(diǎn)。

2.2 miR-199a-5p

Bao等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，SCII組脊髓組織中miR199a-5p的表達(dá)顯著下調(diào)。將miR-199a-5p模擬物、miR-199a-5p抑制劑和生理鹽水分別注入SCII組大鼠髓鞘內(nèi)5 d后檢測miR-199a-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SCII組大鼠BBB評分較假手術(shù)組明顯降低，miR-199a-5p模擬物組較生理鹽水組顯著升高，miR-199a-5p抑制劑組較生理鹽水組顯著降低。此外，在SCII發(fā)生24 h后，與假手術(shù)組比較，生理鹽水組和miR-199a-5p抑制劑組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯增高；miR-199a-5p模擬物組神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低，證明miR-199a-5p對大鼠SCII有抑制作用。

2.3 miR-129-5p

Li等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，SCII發(fā)生12、48 h后，miR-129-5p表達(dá)均明顯下調(diào)，高遷移率族蛋白-1（HMGB1）水平從SCII發(fā)生12 h后開始顯著升高。熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-129-5p負(fù)向調(diào)節(jié)HMGB1。SCII發(fā)生后，損傷細(xì)胞立即釋放HMGB1，并通過趨化因子和細(xì)胞因子募集大量的炎性細(xì)胞因子，損傷脊髓組織。此外，HMGB1在損傷脊髓中的表達(dá)隨著時間的推移而增加。與假手術(shù)組相比，鞘內(nèi)注射miR-129-5p模擬物可顯著抑制HMGB1和TLR3的表達(dá)。綜上所述，miR-129-5p通過抑制HMGB1來減輕SCII后神經(jīng)炎性反應(yīng)。

2.4 miR-27a

Li等［31］通過溴化乙錠（EB）染色滲出法觀察血-脊髓屏障（BSCB）的通透性。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SCII發(fā)生24、72 h時，SCII組EB滲出明顯增加；鞘內(nèi)注射miR-27a模擬物可減輕BSCB功能障礙，表現(xiàn)為SCII發(fā)生24、72 h時EB滲出和熒光染料含量減少；鞘內(nèi)注射抗miR-27a寡核苷酸（AMO-27a）卻加重了BSCB的EB滲漏。與SCII組和陰性對照組相比，鞘內(nèi)注射miR-27a可減輕SCII誘導(dǎo)的TLR4激活和炎性損傷，表現(xiàn)為SCII發(fā)生24、72 h時EB滲出減少，核因子-κB（NF-κB）和IL-1β水平降低。綜上，miR-27a通過抑制TLR4信號通路和NF-κB/IL-1β通路來減輕SCII誘導(dǎo)的脊髓組織炎性損傷，為SCII的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

2.5 miR-186-5p

Chen等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，SCII發(fā)生后miR-186-5p水平顯著降低。鞘內(nèi)注射miR-186-5p模擬物、AMO-186-5P或生理鹽水24 h后，miR-186-5p模擬物組miR-186-5p表達(dá)顯著增加，AMO-186-5p組則相反。與生理鹽水組比較，miR-186-5p模擬物組大鼠神經(jīng)元明顯增多，而AMO-186-5p組大鼠神經(jīng)元壞死或死亡明顯增多。術(shù)前用miR-186-5p預(yù)處理可改善神經(jīng)功能和組織學(xué)評分，減輕脊髓水腫，降低IL-15、IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。綜上，miR-186-5p可通過減輕脊髓水腫來抑制SCII。

2.6 miR-221

Zhao等［33］采集20例SCII患者的血樣，并以20名健康人群的血樣作為對照。AGE1.HN和SY-SH-5Y神經(jīng)細(xì)胞系在OGD條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，SCII患者miR-221的表達(dá)水平低于健康對照組，TNFAIP2的表達(dá)水平高于健康對照組。在AGE1.HN和SY-SH-5Y神經(jīng)細(xì)胞SCII模型中，miR-221表達(dá)明顯下調(diào)，TNFAIP2和炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平均升高，細(xì)胞凋亡百分比增加。以上結(jié)果證明，TNFAIP2是miR-221的靶基因，受miR-221的負(fù)調(diào)控，miR-221過表達(dá)可抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，敲除miR-221基因后炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡增加。綜上，miR-221過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)TNFAIP2誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

2.7 miR-497

Xu等［34］的研究發(fā)現(xiàn)，與SCII組相比，miR-497模擬物預(yù)處理組上調(diào)了miR-497表達(dá)，IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK1）和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的表達(dá)顯著降低。miR-497轉(zhuǎn)染后，作為miR-497潛在靶點(diǎn)的Toll樣受體4（TLR4）、NF-κB和Caspase-3被顯著抑制，從而阻止了炎性細(xì)胞因子和凋亡調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生。ERK、Bax、Bcl-2和Bcl-xl等促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)均隨著IRAK1和CREB的下調(diào)而降低。綜上，miR-497通過抑制IRAK1和CREB信號通路減輕脊髓的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來抑制SCII。

3 結(jié)語與展望

目前對SCII的治療包括藥物治療，如激素沖擊聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)藥物、他汀類藥物、米諾環(huán)素和中藥，還包括缺血預(yù)處理、低溫預(yù)處理和高壓氧療法等。miRNA作為非編碼單鏈RNA，可負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)，在抑制SCII方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在SCII發(fā)生后，正性調(diào)控miRNAs表達(dá)量下降，若高表達(dá)此類正性調(diào)控miRNAs，其對應(yīng)的靶基因表達(dá)量將下降，從而抑制SCII；負(fù)性調(diào)控miRNA在SCII發(fā)生后表達(dá)量升高，對應(yīng)的靶基因表達(dá)量下降，而這些靶基因的翻譯產(chǎn)物卻對SCII有抑制作用，而抑制負(fù)性調(diào)控miRNAs表達(dá)，使靶基因表達(dá)量升高，可抑制SCII。總之，2種不同類型的miRNAs主要是通過減少細(xì)胞凋亡和自噬、抑制炎性反應(yīng)和減輕脊髓水腫發(fā)揮抑制SCII的作用，為臨床治療SCII提供了新思路。

雖然近年來已經(jīng)進(jìn)行了相當(dāng)多涉及miRNA療法的臨床研究，但到目前為止只有一小部分miRNA進(jìn)入臨床開發(fā)階段。miRNA療法的挑戰(zhàn)：①確定不同疾病的最佳miRNA靶點(diǎn)。②設(shè)計miRNA遞送載體。③使候選治療藥物具有更高的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)組織特異性靶向。④避免潛在的毒性和靶外效應(yīng)。⑤miRNA治療的特異性差，可能會損傷其他不需要治療的正常組織和器官，達(dá)不到預(yù)期的治療效果。例如為了克服癌癥中miRNA表達(dá)異質(zhì)性帶來的障礙，需要在疾病進(jìn)展過程中對各種組織在不同時間進(jìn)行多次活檢，以確定該miRNA調(diào)控的mRNA，然后對其進(jìn)行治療操作。為了解決這些難題，近年來，科學(xué)家們正在積極探索其可能的解決方案，包括結(jié)合并參考TargetScan等預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miRNA的靶點(diǎn)，識別與疾病相關(guān)的miRNA和mRNA。此外，在疾病特異性過程中尋找關(guān)鍵調(diào)控miRNA的另一個策略是使用miRNA模擬物或抑制劑進(jìn)行全基因組功能篩選。目前，基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的激增有助于識別藥物開發(fā)的關(guān)鍵miRNA靶點(diǎn)，應(yīng)該能夠使miRNA療法成為現(xiàn)實(shí)。