肌細胞增強因子2C與骨質疏松動物模型研究進展

彭啟華，趙玉馳，王力剛

1.南華大學附屬邵陽醫院，湖南邵陽 422000；2.南方科技大學鹽田醫院骨科，廣東深圳 518000

骨質疏松癥（osteoprosis，OP）是一種以骨量降低和骨組織微結構破壞為特征，導致骨脆性增加、易骨折的代謝性骨病。按病因分為原發性和繼發性兩類，其中原發性常見的有絕經后OP和老年性OP。骨質疏松是由飲食、體力活動、骨基質細胞因子和臨床狀態（如糖尿病、風濕免疫科性疾病和糖皮質激素應用）等引起的成骨細胞和破骨細胞代謝失衡，是目前與年齡有關的主要疾病之一［1］。目前，我國60歲以上人口已超過2.1億，約占總人口的15.5%，65歲以上人口近1.4億，約占總人口的10.1%，是世界上老年人口絕對數最大的國家［2］。隨著人口老齡化日趨嚴重，OP已成為我國面臨的重要公共健康問題。骨質疏松骨折的醫療和護理，需要投入大量的人力、物力和財力，造成了沉重的家庭和社會負擔。而OP的病因眾多，發病機制復雜，成為目前防治的難點。筆者就近年來國內外根據不同病因建立合適的OP動物模型作一綜述，骨質疏松動物模型模擬OP的臨床癥狀及病理生理學變化，對深入研究OP的發病機制、新藥研發、治療方案的制定具有重要意義。

1 骨質疏松模型的動物選擇

用于骨質疏松模型研究的動物主要有狗、兔、羊、大鼠、小鼠及非人類靈長類動物等。在實驗研究中均有各自的優缺點，因此根據研究者的目的，選擇適合的動物研究模型。陳旭［3］報道動物模型的選擇必須滿足以下條件：（1）實驗方便操作。（2）可重復性。（3）適宜性。作為模型的適當性和適合生物體的遺傳一致性。（4）相關性。研究與人體的變化規律在某方面相關聯。（5）符合倫理要求及社會影響。

1.1 狗

成年狗在很多方面與人有相似之處，有很多獨特的優點：（1）易于飼養。（2）骨骼較大，便于內、外固定裝置和取骨小梁密度檢測。（3）狗是雜食動物，與人有相似的消化系統。（4）在骨代謝和骨結構、皮質骨與松質骨比例與人類相似，哈佛重建系統與人類接近，其重建速度比人類快25%，松質骨轉換率是人類的2～3倍［4］。（5）去睪丸的狗會導致骨代謝失衡。Fukuda等［5］研究發現將狗睪丸去除后，骨體積伴隨性激素下降而丟失，表明去睪丸的狗可作為研究因性腺功能減退和男性性功能下降造成OP的動物。（6）狗用于研究廢用性骨質疏松模型較為成功。缺點：狗的骨骼代謝對雌激素的依賴性較低，去勢后引起骨丟失不明顯。因此，不適合用于絕經后骨質疏松動物模型研究。

1.2 兔

兔是目前應用動物模型研究最多的動物之一，性情溫馴，易于飼養，成本低，兔耳的靜脈網發達，易取血檢測。兔和人的骨骺相似，它們在6～8個月內實現骨骺的完全閉合，且具有類似于人類活躍的哈佛重塑系統，骨轉換比其他智齒動物和靈長類動物更快，骨丟失更加顯著［6］。

1.3 羊

羊除了有溫馴、方便飼養優點外，成年羊具有自動排卵的生理特征，這與成年女性排卵周期相似。但缺點是沒有自然絕經期。而且，羊是反芻動物，不適合口服給藥研究。去卵巢的雌性羊是研究絕經后骨質疏松動物模型一種不錯的選擇。Tyler等［7］對比去卵巢（OVX）后，綿羊的脊柱和股骨遠端骨小梁微結構的改變，發現脊柱是研究OVX綿羊模型骨骼的首選解剖部位，并證實從去勢第一年以后骨結構變化趨于穩定，類似女性絕經后早期快速骨丟失之后的變化規律。Newton等［8］也證實OVX綿羊是雌激素缺乏引起骨小梁結構改變的有效模型，尤其是對絕經早期的婦女的研究。

1.4 大鼠

大鼠被認為是研究與繁殖功能喪失相關的骨骼變化首選動物模型。具有價格便宜、易于飼養、操作方便等優點，且大鼠壽命約3年左右，易于研究衰老對骨骼代謝的影響。目前常用的大鼠品種有Sprague-Dawley（SD）、Wistar、Brown Norway（BN）、Wistar京都大鼠等，FDA指南沒有具體說明哪種品系的大鼠最適合OP的研究，但SD和Wistar大鼠是最常用的品系。大鼠6月齡以后，股骨骨密度（BMD）變化較小，12月齡后基本達到平臺水平，但選用6月齡大鼠作為研究模型較為常用。通過研究大鼠不同年齡、去勢時間對骨骼的影響中，證實6月齡大鼠骨質疏松反應最好。大鼠同樣具有與人類相似的生殖周期。研究證實大鼠骨骼會受到性腺類固醇定期波動的影響，尤其是卵巢分泌激素的喪失更為敏感。因此，大鼠是目前研究絕經后骨質疏松最受歡迎的動物模型。但也有缺點：（1）去勢后的骨代謝變化在短期內與絕經后的變化相似，但從長期變化來看它們是不同的。（2）與皮質骨相比，OVX大鼠松質骨的干預后變化更好、更快，研究去勢后大鼠皮質骨變化可能需要更長時間。（3）OVX成年大鼠存在骨骼縱向生長可能。（4）大鼠不存在自然脆性骨折。

1.5 小鼠

小鼠是醫學研究常用的動物之一，同樣具備和大鼠相似的優點，盡管目前作為研究骨質疏松動物模型頻率并不多，但在未來的研究對雌激素缺乏導致OP的發病機制及診治的動物模型比大鼠可用性更有優勢。隨著近年來對遺傳基因分子在骨生理學領域的研究和應用，通過導入或敲除目的基因對小鼠進行骨代謝遺傳因素的研究，觀察其表型特征和病理變化成為OP研究領域的熱門。

1.6 非人類靈長類動物

以上動物模型在實際上存在一些不足之處，近年來有對大型動物模型研究骨質疏松的趨勢。非人類靈長類動物模型是目前評價新藥實體治療和預防雌激素缺乏骨丟失和OP藥物的安全性和有效率性最廣泛的大型動物模型。其中獼猴和狒狒常用之一。優點包括：（1）根據FDA指南，除嚙齒動物外，靈長類動物是用于OP治療的主要大動物模型。（2）在遺傳規律和直立行走姿勢上與人類有許多相似。（3）在骨生物力學特征和組織器官有許多同源性，尤其是在骨小梁和皮質骨重塑過程、月經周期和生殖激素模式與人類相似。在老年雌性猴子（食蟹猴和恒河猴）中，OVX會導致骨高轉換和快速骨丟失狀態，OVX后停止周期性分泌生殖類激素導致的長期后遺癥類似于婦女發生的雌激素耗盡和絕經后骨丟失［9］。靈長類非人類動物模型缺點：飼養和馴養條件嚴格，飼養比較困難，價格昂貴，且靈長類動物和人一樣，可攜帶各種傳染性疾病［10］。

2 骨質疏松模型

2.1 內分泌的缺失

研究證明絕經后骨質疏松的發生與雌激素水平下降明顯相關，由此可用手術直接切除動物雙側卵巢使雌激素水平降低，誘發與女性絕經后相似的骨量丟失和骨結構改變，建立骨質疏松的實驗模型。有報道觀察早期接受雙側OVX的雌性動物會過早經歷絕經后癥狀和副作用，類似于人類更年期狀態，因此動物OVX可以作為研究絕經后骨質疏松模型［11］。但并不是所有動物都適合研究絕經后骨質疏松，需要考慮眾多因素，如動物模型有類似于人類月經周期變化的繁殖周期，且在這樣的模型中，在全年周期變化中骨骼會受到性激素波動的影響。而季節性繁殖的動物中，每年經歷一次或兩次的繁殖周期，通常是不能反映OVX后骨骼變化。大鼠OVX術以背側、腹側皮膚切口兩種方式為主。李明等［12］應用兩種大鼠OVX術式對比，通過觀察兩種手術用時、出血量、術后出現感染等并發癥、及測量BMD等情況，發現背側部雙切口操作更為簡單，手術用時少，術后并發癥少，安全性更高。Fujita等［13］通過OVX和睪丸切除（ORX）對雌性老鼠和雄性老鼠下頜骨髁突形態影響對比研究表明，這兩種方法能有效減少骨小梁體積。并發現雌性老鼠的變化比雄性小鼠更顯著。大鼠OVX的成功主要通過對比大鼠體重、子宮的重量變化，動情周期、激素譜［包括雌二醇、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、孕酮的周期變化）］來證實［14］。甲狀旁腺切除誘導甲狀旁腺素分泌缺失，導致1，25-（OH）2D3合成減少，腸道鈣、磷吸收減少，誘發OP。腦源性骨質疏松，如通過破壞下丘腦-垂體軸或弓狀核導致神經內分泌細胞功能減退、缺失，成功建立誘導大鼠骨質疏松動物模型［15］。

2.2 類固醇類激素誘導

隨著糖皮質激素（Glucocorticoid，GC）在臨床的廣泛應用和相關并發癥的研究，發現GC誘導OP發病率僅次于絕經后骨質疏松和老年性骨質疏松。GC主要對骨細胞、成骨細胞和破骨細胞的直接損傷，尤其是抑制成骨細胞的增值和分化，促進成骨細胞和骨細胞的凋亡，延長破骨細胞的生存時間，同時減少血管內皮生長因子釋放、抑制骨骼內血流。抑制腸鈣吸收，促進尿鈣的排除，導致負鈣平衡，從而促進骨吸收，骨量減少、骨強度降低，骨折風險增加［16］。研究表明［17］，由于OVX或GC單獨干預誘發骨質疏松有耗時、不一致等局限性，以及與OVX相比，雖然GC可能誘導更多進行性骨丟失，但在GC停止后，骨丟失會發生逆轉。因此，越來越多傾向于兩者聯合干預，可迅速誘導明顯的骨丟失，且沒有像單獨應用GC干預停止后，導致骨丟失反彈［17］。Diana等［18］通過OVX和GC聯合應用證明可在短時間內建立綿羊骨質疏松模型。

2.3 炎癥誘導導致骨質疏松

研究表明，類風濕性關節炎（RA）是慢性炎癥導致的OP。表現為局部骨質減少，尤其是關節附近的骨質［19］。研究表明關節附近骨質丟失是炎癥細胞因子如白細胞介素（IL-6，一種有效的破骨細胞活性刺激物）或腫瘤壞死因子（TNF）持續影響的結果，以抗環瓜氨酸蛋白自身抗體的RA患者中常見。Hoshino等［20］利用膠原誘導關節炎（CIA）大鼠研究早期RA和幼年RA患者炎癥關節附近骨質疏松的機制，結果表明炎癥關節附近的骨質疏松是由于CIA大鼠的免疫反應引起的骨形成和骨吸收之間失衡，并發現骨形成的減少能在一定程度上先于關節炎的臨床發作。Enokida等［21］探討關節炎對2月齡和7月齡CIA大鼠脛骨BMD的影響，結果表明成年CIA大鼠的骨丟失類似于人類RA早期發生的OP，并闡明成年CIA大鼠較幼年CIA大鼠更適合作為RA繼發性骨質疏松的實驗模型。關節炎誘導骨質疏松動物模型在狗的模型中已經開展，通過關節內注射卡拉膠誘發關節炎，導致關節炎肢體的骨質疏松［22］。將來有望通過關節腔內注射刺激性物質誘導關節炎的骨質疏松模型，為研究人類關節炎相關并發癥提供更有價值信息。

2.4 廢用性骨質疏松模型

骨的負荷力是影響骨代謝的關鍵因素之一。與影響全身骨骼結構改變的OVX或類固醇激素誘導OP相比，廢用性OP是由于骨骼的機械負荷減少而誘發的骨丟失，降低局部骨骼的機械應力會抑制成骨細胞介導的骨形成，加速破骨細胞介導的骨吸收，從而誘發廢用性OP。Watanabe等［23］對人類長期臥床90天的研究中發現，骨丟失是由于骨吸收顯著增加并伴有骨形成受到輕微抑制導致。Zerath等［24］比較懸浮大鼠與正常負載大鼠發現，無論食物類型如何，懸浮大鼠的骨骼縱向生長率、松質骨體積和骨形成率較低，并證實骨骼低負荷導致骨形成障礙和骨細胞內生長因子代謝異常與局部改變有關。其他有尾部懸吊、后肢固定、坐骨神經切除、肌腱切除和石膏管型固定等方法誘發廢用性骨質疏松動物模型。臨床中以長期臥床、石膏托外固定、及中樞或外周神經損傷導致運動性截癱等是常見的原因。隨著人口老年化及創傷因素的增多，導致廢用性骨質疏松的患病率逐年增加。

2.5 基因敲除誘發骨質疏松動物模型的建立

近年來，隨著醫學的發展和對OP的深層次的研究發現，OP是一種多基因導致的疾病，參與骨代謝因子的缺乏和過表達會導致骨骼的變化。

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是骨基質中含量較豐富的非膠原蛋白之一，由成骨細胞和破骨細胞產生。Yoshitake等［25］報道通過外周定量CT分析顯示，野生型小鼠哈佛后骨體積減少約60%，而OPN缺陷小鼠哈佛后骨體積僅減少約10%，證實與野生型小鼠相比，OPN基因敲除小鼠對卵巢切除誘導的骨吸收具有抵抗力。護骨素（Osteoprotegerin，OPG）又稱破骨細胞生成抑制因子（OCIF）或TNF受體樣分子（TR1），是TNF受體家族的一員，通過抑制破骨細胞的分化和活化來調節骨量，在小鼠中過表達OPG導致嚴重的骨化癥，而OPG缺陷小鼠表現出骨吸收增加、破骨細胞數量和活性增加、BMD減低以及骨折的高風險，最終導致全面骨質疏松［26］。研究發現OPG［27］與OPN不但與骨質疏松有關，還與血管鈣化性心血管疾病存在相關性。文獻報道c-Abl蛋白（是一種非受體酪氨酸激酶）缺陷的小鼠會發生，證實c-AbI對成骨細胞的分化和骨形成有積極調節作用，而缺乏c-AbI的小鼠表現為OP。Biglycan（BGN）是存在于骨骼和其他非骨骼結締組織中一種細胞外基質成分。Xu等［28］研究表明BGN敲除小鼠表現為生長速度減慢和骨量減少，并隨著年齡的增長變得更加明顯。并發現骨的強度和彈性由另外一種細胞外基質有序礦化（ECM，由I型膠原和一系列非膠原蛋白組成），ECM缺乏小鼠會導致骨重建減少，骨量嚴重丟失，并隨著年齡的增長變得更加明顯。因此，這些小鼠可作為研究骨細胞外基質蛋白在骨質疏松中作用的動物模型。

硬化蛋白（Sclerostin，SOST）是一種由SOST基因（人類SOST基因位于17q12-21，長約200 kb，含有兩個外顯子和一個內含子，編碼由骨細胞分泌抑制成骨的SOST）編碼分泌型蛋白。SOST是骨形成的負性調節因子，與脂蛋白受體相關蛋白（LRP4、LRP5、LRP6）受體結合。作為經典Wnt信號的細胞外抑制因子，作用于遺傳性疾病，如硬化癥或Van Buchem（VB）病，導致SOST終生缺失或減少的患者。Ominsky等建立抗骨SOST單克隆抗體（ScI-Ab）哈佛大鼠和幼年食蟹猴骨質疏松動物模型，結果顯示ScI-Ab對SOST的抑制增加骨形成，減少骨吸收，從而改善骨結構、骨量和骨強度。目前，對于骨SOST單克隆抗體研究已經進入臨床試驗，有望成為治療OP的新靶點。

近年來，骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP，是一種分泌型信號分子）引起越來越多學者的關注，尤其是BMP-2的研究。研究證明，BMP-2是存在骨基質內骨誘導生長因子BMPs家族成員之一，BMP-2受體具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構，其信號傳導機制與轉化生長因子（transforming growth fator，TGF-）受體類似，功能主要是在骨折愈合中促進成骨細胞分化及其他成骨因子的表達，進而導致骨骼的形成［29］。劉銘等［30］對大鼠股骨上端行局部注射BMP-2，行BMD檢查后，證實局部注射BMP-2可快速、有效的提高局部的BMD及骨生物力學強度，增強局部抗骨折能力，這將為老年髖部骨折提供一種新穎防治措施。

Sclerostin與BMP的關系：Johanna等［31］研究發現小鼠和人體內識別一種cDNA，可編碼一種新型的BMP抑制劑，和Sclerostin最為同源（其中氨基酸序列同源37%）。WinkIer等［32］報道硬化癥是一種由于SOST表達缺失而導致骨量增加的疾病，SOST基因蛋白產物Sclerostin與BMP受體競爭結合，可減少BMP信號傳導，抑制骨細胞礦化，過表達SOST的轉基因小鼠表現為低骨量和骨脆性減弱，證明骨細胞釋放的Sclerostin通過下調BMP活性來調控成骨細胞的增值、分化和成熟成骨細胞的活性。隨著對BMP-2的研究深入，發現很多藥物可以上調BMP-2的作用，如他汀類藥物、雌激素等，為將來研究以BMP-2為靶點治療OP提供方向。

2.6 維A酸大鼠骨質疏松動物模型

破骨細胞中維生素A信號傳導是通過維A酸受體來調節。Shingo等［33］從兔中提取破骨細胞，發現組織蛋白酶K/OC-2在成熟破骨細胞中高表達，并證實全反式維A酸可在轉錄水平上調節成熟破骨細胞組織蛋白酶K/OC-2的基因表達，即維A酸可通過破骨細胞調節部分骨形成和代謝。目前，已有通過口服維A酸成功建立大鼠骨質疏松模型［34］，來研究維A酸導致骨質疏松的發生機制及防治藥物。

3 MEF2C與骨質疏松的關系

肌細胞增強因子（Myocyte enhancer factor-2，MEF2，是與多種肌肉特異基因控制區的富含A/T的DNA序列結合）最先描述是在骨骼肌細胞中高表達的轉錄因子，后來發現在神經元及心肌細胞中也有高表達［35］。哺乳動物的MEF2家族轉錄因子由MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D組成。MEF2C與MEF2D被證明是軟骨內骨形成過程中軟骨細胞肥大必須存在的因素［36］。在股骨皮質骨中以骨細胞為主的定量基因表達分析表明，MEF2C的表達最強。

目前，對骨質疏松的病因、發生機制深入研究，發現Wnt/-catenin信號通路在骨重塑中起關鍵作用［37］，而SOST基因編碼Sclerostin蛋白與LRP5/6受體結合拮抗Wnt/-catenin信號傳導通路，即Sclerostin是Wnt信號的拮抗劑，進而影響骨細胞及成骨細胞功能［38］。文獻報道組蛋白脫乙?；?（HDAC5）在體內外對骨SOST水平的負性調節，利用shRNA慢病毒感染Ocy454細胞行HDAC5基因敲除小鼠，表現出SOST表達水平升高，SOST陽性骨細胞增多，Wnt信號活性降低，骨小梁密度降低，成骨細胞形成減少。人類缺乏Sclerostin會導致骨硬化癥和VB病，進一步研究發現是由Wnt信號通路過度激活引起全身骨骼增生癥［39］。報道發現SOST基因的遠端增強子進化保守區5（Evolutionarily conserved region 5，ECR5），而MEF2是ECR5區域中轉錄因子的結合位點，在骨代謝中調節SOST的表達。在VB病缺失區發現一個增強子ECR5，并在體外證明ECR5的轉錄活性受MEF2C轉錄因子調控，并證實缺乏ECR5或MEF2C的小鼠由于骨形成率升高而導致高骨量［40］。Nicole等也證實缺乏SOST特異性調控元件ECR5會使嚙齒類動物發生VB病，而在成年骨骼中MEF2C是依賴于ECR5的SOST轉錄激活的重要轉錄因子［39］。Olivier等通過實驗證明，甲狀旁腺激素（PTH）可以抑制SOST的表達，而SOST在成人骨細胞中的表達和PTH對其的抑制作用是由控制SOST骨增強劑的MEF2A、C、D轉錄因子介導［40］。有研究進一步證實MEF2C是骨細胞中SOST表達所必須的因素，并通過Dmp1-Cre誘導MEF2C缺失，導致3.5個月齡和5～6個月齡小鼠股骨皮質骨中SOST表達減少40%和70%，并發現MEF2C突變雄性大鼠皮質抗破骨細胞因子和Wnt/-catnein信號的靶基因OPG的表達也增加了70%，證實MEF2C也可以通過調節破骨細胞骨吸收來調控骨量。

目前，盡管SOST基因與MEF2C之間關系并未明確，但通過MEF2C-SOST-Wnt信號軸來揭示骨形成的機制，探討MEF2C影響SOST基因表達來調控骨代謝，是MEF2C治療骨質疏松的關鍵。

4 展望

近年來，對骨質疏松的預防和治療由于長期治療的風險/收益比低而受到質疑，迫切需要安全有效的替代療法來治療OP。因此，通過模擬人類骨代謝相關的變化建立絕經后內分泌減少、激素誘導以及廢用性、基因敲除等誘導骨質疏松動物模型，對骨質疏松的病因及發生機制深層次的研究探討。本課題下一步將從MEF2C調控骨代謝的作用機制著手，為將來研究骨質疏松的病因、發生機制提供實驗依據，為防治措施提供理論基礎，為治療骨質疏松提供新策略。