血清外泌體miRNA-21、MCP-1 在以孤立結節為主的肺癌和肺結核中的表達水平研究

郭帥 呂艷 張偉 張靜 謝毅 趙媛媛 周麗云 于學燕

肺癌是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤,肺結核也是傳統的高發病、多發病［1-3］。近年來肺部結節的檢出率急劇增多,如何盡快定性是胸科領域面臨的主要挑戰之一。研究表明,miRNA、趨化因子在腫瘤和結核病發生發展中具有重要作用［4,5］,但通過提取血清外泌體中的miRNA 系統規范對肺癌診治的標準化方案尚未確立,MCP-1 在結核結節形成并持續的作用機制尚不清楚。miRNA 屬于內源性非編碼小分子RNA,可參與細胞增殖、分化及凋亡等過程,其在多種組織中均有表達,且具有較好的組織特異度。外泌體可介導miRNA 轉運使其穩定存在于循環系統中,故血清外泌體miRNA 具備了成為腫瘤生物標志物的條件。本研究旨在通過檢測血清外泌體miRNA-21 和血清MCP-1 在不同屬性肺結節患者中的表達情況,評價其在以孤立性肺結節為主的肺癌和肺結核中的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月～2022 年1 月山東省公共衛生臨床中心(山東省胸科醫院)60 例肺癌患者作為肺癌組,60 例肺結核患者作為肺結核組,另選取同期60 例健康體檢者(成年人)作為對照組。肺癌組：男36 例,女24 例；年齡36～84 歲,平均年齡(53.7± 12.4)歲；腺癌31 例,鱗癌20 例,腺鱗癌1 例,小細胞癌6 例,大細胞癌2 例。肺結核組男32 例,女28 例；年齡23～79 歲,平均年齡(50.9±10.2)歲；菌陰肺結核53 例,菌陽肺結核7 例；其中伴發胸腔積液9 例。健康對照組男38 例,女22 例；年齡26～77 歲,平均年齡(52.4±9.8)歲。三組一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標準 肺癌組和肺結核組納入標準：肺部影像學表現類圓形密度增高的陰影,可分為孤立性肺結節或彌漫性肺結節；既往無腫瘤病史；術前影像學檢查無胸腔積液且縱隔淋巴結腫大≤1 cm；術前檢查無遠處轉移。排除標準：3 個月內服用免疫抑制劑或免疫增強藥物者；患有嚴重心臟、肝臟、腎臟、脾臟疾病者；患有腫瘤、肺真菌病、精神疾病、癲癇、免疫過敏疾病；有家族性基因疾病；人類免疫缺陷病毒、人類皰疹病毒、肝炎病毒等感染患者；長時間應用激素史,有器官移植病史或其他可能導致免疫功能不全的疾病。所有病例均經胸部CT 證實為肺內結節,最大結節直徑≤3 cm,均未行放療、化療及抗結核治療。所有患者經手術或CT 引導下經皮肺穿刺術或經電子氣管鏡Lungpro 導航定位穿刺活檢后明確組織學病理診斷。肺癌診斷標準根據美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南非小細胞肺癌(2018 年第6 版)和小細胞肺癌 (2018 年第2 版),肺結核診斷根據《WS288-2017 肺結核診斷》。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.3 方法 采取三組研究對象靜脈血5 ml 置于EDTA抗凝管中,4℃條件下24 h 內予以離心處理3000 r/min,離心15 min,吸取上層血清置于-80℃的冰箱中保存待檢,整個過程避免溶血。

1.3.1 儀器與試劑 超低溫冰箱為美國Thermo 賽默飛產品,高速離心機為美國 ThermoST16R 產品,電泳儀為ENDURO Gel XL 電泳系統(型號 E0160-230V)；微量分光光度計為美國NanoDrop One 產品,TaqManmiRNA 反轉錄試劑盒及Applied Biosystems 7300 PULAS 實時熒光定量PCR 儀購自美國AB 公司。酶標儀為美國Biol-Tiok 公司(Bio-RADModel 550)。BCA 蛋白濃度測定試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司),兔抗人CD63 一抗和二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體)為美國System Biosciences 產品；透射電鏡為日產JEOL-1400Flash。

1.3.2 血清外泌體的提取及鑒定 ①提取方法：采用Exo Quick-TM 試劑提取,按照試劑說明進行操作,加入1.8 ml 沉淀劑(5∶1),混勻后4℃條件下靜置過夜；將孵育好的樣品4℃條件下以3000 r/min 離心30 min,棄上清,獲得的沉淀即為外泌體,將其以200 μl 分裝,置于-80℃保存備檢。②形態觀察：提取的外泌體懸液30 μl 滴加于帕拉膠上,覆蓋銅網表面,室溫靜置 45 min,用PBS 清洗銅網3 次,3%戊二醛固定10 min,蒸餾水清洗,2%乙酸鈾酰對比,用透射電鏡觀察其形態。③蛋白定量：根據BCA 試劑盒說明書將稀釋后濃度為0.5 mg/ml 的蛋白標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl 順序加到96 孔板中,各孔加入PBS 補充到20 μl；外泌體蛋白樣品取1 μl 加到96 孔板中,加PBS到20 μl；各孔加入200 μl BCA 工作液,混勻,37℃孵育45 min 后放入酶標儀,于585 波長測定各孔吸光度。④凝膠電泳：將20 μl 樣品加入5 μl 5×蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min,上樣,濃縮膠80 V 電泳30 min,分離膠 100 V 電泳90 min,使用0.25%考馬斯藍染液染色 2 h,脫色液脫色至條帶明顯,使用Biorad 成像儀拍照。⑤檢測鑒定：使用Western Blot 法,將分離后的蛋白轉印至PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉的TBS-T 封閉1 h 后,按1∶400 稀釋一抗(兔抗人CD63 抗體),與膜共置反應,4℃過夜；TBS-T 緩沖液洗膜3 次,15 min/次,加入二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體),室溫孵育2 h,洗膜3 次,15 min/次,顯色觀察。

1.3.3 miRNA-21 的檢測利用Taqman miRNA 逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,以cDNA 為模版,在7300 PULAS PCR 儀利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRTPCR)對miRNA-21 進行定量實驗。按照試劑盒說明書,反應條件為預變性95℃10 min、95℃15 s、60℃ 1 min,擴增40 個循環。所有樣品均做3 個平行孔,循環數取其均數。以U6B 為內參,miRNA-21 的相對表達量用2-ΔΔCt表示,ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct 管家基因)實驗組-(Ct 目的基因-Ct 管家基因)對照組均數。

1.3.4 MCP-1 的檢測 采用ELISA 方法,預先向 96 孔板中加入稀釋液100 μl,向各反應孔中各加100 μl血清樣品及標準品,封閉板孔,每孔加入MCP-1 結合物各200 μl,封板,并于室溫下孵育2 h。應用PBS 緩沖液沖洗孔板,依次加入底物溶液200 μl,于室溫下避光孵育30 min,加入中止液反應30 min,并將樣品置于酶標儀A450 中測定,計算各指標濃度。ELISA 測定方法及步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 觀察指標 比較三組血清外泌體miRNA-2、MCP-1 水平,分析血清外泌體miRNA-21 對肺癌及血清MCP-1 對肺結核的診斷效能。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差 (±s)表示,采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；采用ROC 曲線分析血清外泌體miRNA-21 和MCP-1在肺癌及肺結核診斷中的價值。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清外泌體miRNA-21 水平比較 肺癌組、肺結核組血清外泌體miRNA-21 水平均高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；肺癌組血清外泌體miRNA-21 水平高于肺結核組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 三組血清外泌體miRNA-21 水平比較(±s,pg/ml)

表1 三組血清外泌體miRNA-21 水平比較(±s,pg/ml)

注：與對照組比較,aP＜0.05；與肺結核組比較,bP＜0.05

2.2 三組血清MCP-1 水平比較 肺癌組、肺結核組血清MCP-1 水平均高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；肺結核組血清MCP-1 水平高于肺癌組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 三組血清MCP-1 水平比較(±s,pg/ml)

表2 三組血清MCP-1 水平比較(±s,pg/ml)

注：與對照組比較,aP＜0.05；與肺癌組比較,bP＜0.05

2.3 血清外泌體miRNA-21 對肺癌及血清MCP-1 對肺結核的診斷效能分析 對血清外泌體miRNA-21表達水平行ROC 曲線分析,結果表明,血清外泌體miRNA-21 對肺癌的診斷敏感性為96.58%,特異性為72.42%,曲線下面積為0.910［95%CI=(0.870,0.949)］。對血清MCP-1 表達水平行ROC 曲線分析,結果表明,血清MCP-1 對肺結核的診斷敏感性為95.18%,特異性為 75.23%,曲線下面積為0.898［95%CI=(0.855,0.940)］。見圖1。

圖1 血清外泌體miRNA-21 對肺癌及MCP-1 對 肺結核診斷的ROC 曲線圖

3 討論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤,已成為當今對人民健康危害最大的惡性腫瘤之一［2］。2020 年全世界新發結核病患者987 萬,我國結核病新發患者數為 84.2 萬(2019 年83.3 萬),我國仍然屬于結核病高負擔國家［3］。所以,肺癌與肺結核是最需要鑒別的兩種疾病。典型的肺結核通過胸部X 片及CT 檢查基本能做出準確診斷,但當結核病灶表現不典型時影像學診斷比較困難。隨著人工智能、大數據等深度學習的興起,提高肺癌患者生存率成為了現實。國情的特殊性,患者的依從性、身體條件、結節位置和大小等諸多因素限制了穿刺或手術,目前腫瘤標志物的特異性和敏感性欠佳,而CT篩查的精準度往往也需要依賴設備好壞、影像診斷團隊水平,有時還會出現不同醫院CT 結果差別迥異的情況,諸多原因疊加,致使患者心理負擔沉重、精神壓力巨大［4］,給早期診斷帶來了困擾。

外泌體是細胞“內吞-融合-外排”過程中分泌的直徑30～200 nm 的具有脂質雙層膜結構的微小囊 泡［5］,1980 年由Trams 最先發現,其廣泛存在于血清、唾液、乳汁、腦脊液、尿液和精液等體液中,含有多種蛋白質、DNA、mRNA、miRNA、長鏈非編碼RNA［6,7］。外泌體miRNA 生化性能穩定,不易被核糖核酸酶消化以及血液溫度、酸堿度等不利因素的干擾,可通過無創方式獲得,易于保存,使得血清外泌體miRNA 成為液體活檢的技術之一［8-10］,具備了成為腫瘤診斷生物標志物的條件。國外有研究miRNAs 對無癥狀的高危人群進行檢測,推薦miR-Test 用于肺癌一線篩查。腫瘤細胞來源的外泌體中含有大量表達miRNA-21,較正常人表達明顯上調,上調倍數為3.06 倍［11-13］,其作用于骨形態發生蛋白通路相關基因、TCF21-KISS1 基因和p53 等靶基因促進腫瘤細胞的增殖,抵抗細胞分化和凋亡［14,15］。Meta 分析顯示,血清外泌體miRNA-21是一種將肺癌患者與健康者和良性肺疾病患者區分開的相對有前途和有效的生物標志物［4］。本研究結果顯示,肺癌組、肺結核組血清外泌體miRNA-21 水平均高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；肺癌組血清外泌體miRNA-21 水平高于肺結核組,差異有統計學意義(P＜0.05)。上述結果與國內外研究結果一致。利用ROC 曲線評價miRNA-21 的臨床診斷能力,ROC 曲線結果顯示,血清外泌體miRNA-21 對肺癌的診斷敏感性為96.58%,特異性為72.42%,曲線下面積為0.910。但是miRNA-21 并不是肺癌的特有標志,其作為肺癌的早期診斷方法仍需要結合其他腫瘤標志和臨床資料。

結核病遺傳易感基因研究發現MCP-1 及其受體在結核免疫中發揮重要作用,參與細胞遷徙、抗原遞呈和吞噬,能激活并趨化單核細胞、巨噬細胞等向感染部位聚集,以吞噬并殺滅結核分枝桿菌,如果MCP-1缺失,可能導致感染擴散、病情加重甚至死亡［16］。研究發現,MCP-1 參與誘導單核細胞聚集到感染部位形成結核結節并持續存在［17］。本研究結果顯示,肺癌組、肺結核組血清MCP-1 水平均高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；肺結核組血清MCP-1 水平高于肺癌組,差異有統計學意義(P＜0.05)。ROC 曲線結果顯示,血清MCP-1 對肺結核的診斷敏感性為95.18%,特異性為75.23%,曲線下面積為0.898。由此表明MCP-1 除了參與肺結核免疫調節及炎性因子生成外,還可與相應受體或配體結合促進癌間質炎性細胞浸潤、腫瘤血管生成及影響癌細胞本身生物學行為。

綜上所述,對以孤立結節為主的肺癌和肺結核的鑒別診斷中,通過檢測血清外泌體miRNA-21 及MCP-1 表達水平有積極的臨床價值,作為一種無創、特異的早期肺癌診斷標志物可以提高肺癌和不典型肺結核的診斷效能,值得臨床推廣。本研究中對于外泌體的提取過程復雜、設備試劑較昂貴也需要改變,尋找一種提取的新思路、新途徑和新方法對于推動外泌體與腫瘤相關研究的發展具有重要的價值。鑒于本研究樣本量有限,仍存在誤差的可能,其敏感性、特異度還需在大樣本的人群中進一步驗證。