免疫熒光法應用于小兒上呼吸道感染微生物快速檢驗中的效果分析

李革 余怡如 陳放

作為兒科常見疾病,上呼吸道感染發病率高且病情易反復,多發于兒童群體,發病時不及時若治療不但會引發小兒哮喘,還會嚴重影響患兒的成長發育［1］。有研究顯示,小兒上呼吸道感染的發生與病毒感染密切相關,病毒感染所致的小兒上呼吸道感染占80%以上,感染病毒類型較多,除了常見流感病毒和腺病毒之外,還包括副流感病毒等。傳統病毒分離法雖然可以對感染病毒進行檢測和鑒定,但其操作相對復雜,增加了臨床應用難度［2,3］。免疫熒光技術通過結合免疫學方法與熒光標記技術,不但檢測效率高,而且敏感性和特異性均較強,因此在臨床診斷中被廣泛應用。為了探討在小兒上呼吸道感染微生物快速檢驗中免疫熒光法的應用效果,本研究選取本院2021 年1～12 月收治的400 例上呼吸道感染患兒作為研究對象,具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2021 年1～12 月收治的 400 例上呼吸道感染患兒作為研究對象,其中男210 例,女190 例；年齡2 個月～10 歲,平均年齡(4.53±0.34)歲；體重6～41 kg,平均體重(15.75±2.56)kg；病程3～72 h,平均病程(18.66±3.23)h；感染部位：咽部感染237 例,鼻部感染163 例。納入標準：經相關檢查和臨床診斷確診,符合相關診斷標準［4］。排除標準：①存在凝血功能異常和患有血液系統疾病及其他慢性病患兒；②存在意識和認知障礙患兒；③已接受激素或抗病毒治療患兒；④臨床資料有缺損患兒。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 熒光顯微鏡,旋渦振蕩器,離心機、由優寧維提供的單克隆熒光標記抗體和呼吸道病毒抗原檢測試劑盒,試劑盒包括腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒A 型和B 型、副流感病毒2 型和3 型、肺炎支原體等。

1.2.2 標本采集和制片 標本采集使用小兒微細型鼻咽植絨拭子深入患兒鼻腔6～8 cm 旋轉2 圈完成采集,將標本保存于生理鹽水塑料試管中。使用旋渦振蕩器對標本中的細胞進行振蕩將植絨拭子上的細胞振落。將植絨拭子取出后,對標本以2000 r/min 轉速離心 10 min,將上清液取出后,觀察是否有較多剩余沉淀,較多則再次進行離心處理,合格后將黏液去除并搖勻。在板孔中滴入細胞懸液,之后將25 μl 細胞懸濁液加入,在溫度為35℃干燥箱中干燥處理10 min 后使用冷丙酮固定。

1.2.3 檢測方法 在樣孔細胞中滴入熒光抗體20 μl,置于保濕箱中進行孵育0.5 h,分別使用洗滌液和蒸餾水進行反復洗滌3 次后,進行干燥處理。在玻璃樣孔中滴入1 滴細胞液,置于熒光顯微鏡小進行觀察。熒光標記的病毒克隆抗體結合抗原后,形成免疫熒光抗原抗體復合物。有綠色熒光的為陽性感染細胞,無熒光的為陰性未感染細胞。調整顯微鏡倍數,為400 倍,熒光細胞2 個以上為陽性。陽性對照孔內細胞感染病毒類型不同。

1.3 觀察指標 分析病毒抗原陽性檢出情況、病毒類型和年齡、季節分布特點。

2 結果

2.1 病毒抗原陽性檢出情況 400 例患兒中345 例檢出病毒抗原陽性,陽性檢出率為86.25%(345/400)。

2.2 病毒類型 345 例病毒抗原檢出陽性患兒中,195 例為流感病毒,占比56.52%；65 例為腺病毒,占比18.84%；34 例為呼吸道合胞病毒,占比9.86%；25 例為副流感病毒,占比7.25%；12 例為腸道病毒,占比3.48%；間質肺病毒和其他各7 例,占比2.03%。其中占比最高的為流感病毒,明顯高于其他類型病毒。見表1。

表1 345 例病毒抗原檢出陽性患兒的病毒類型(n,%)

2.3 年齡分布情況 345例病毒抗原檢出陽性患兒中,1～6 個月、7～12 個月、13～24 個月和＞24 個月患兒占比分別為46.38%、27.54%、14.49%和11.59%,其中1～6 個月患兒占比明顯高于其他年齡段。見表2。

表2 345 例病毒抗原檢出陽性患兒的年齡分布情況(n,%)

2.4 季節分布情況 小兒上呼吸道病毒感染呈現出季節性特點,病毒感染主要集中于春冬季,夏秋季少發,其中流感病毒主要集中在冬季,副流感病毒集中在春季。見表3。

表3 345 例小兒上呼吸道病毒感染的季節分布情況(n)

3 討論

作為兒童感染性疾病中的常見疾病,發病率較高,在發生上呼吸道感染時,患兒會出現咽喉疼痛、干癢、充血等癥狀,對患兒食欲造成嚴重影響。除此之外,上呼吸道感染還會繼發鼻塞、打噴嚏、流鼻涕等癥狀,同時患兒還會出現發熱、頭疼等,病情發展嚴重甚至還會導致肺炎發生,在對患兒健康造成影響的同時也對其正常發育造成影響［5］。患兒因為年齡較小,對于自身病情、病因等無法準確描述,因此也增加了臨床診斷難度。超過80%的兒童呼吸道感染疾病由病毒感所致,通過進行免疫熒光法檢測不但可以對患兒疾病進行有效診斷,而且可以對患兒病情嚴重程度進行判斷［6］。

上呼吸道感染的發生與多種病毒有關,包括腺病毒、流感病毒和副流感病毒等。近幾年來,細菌性呼吸道感染發生率因抗生素在臨床的廣泛使用逐漸降低,而病毒性呼吸道感染發生率逐漸上升［7］。在本次研究中,345 例檢出陽性患兒中病毒類型包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腸道病毒、間質肺病毒等。在康月茜等［8］的研究中,使用直接免疫熒光法對2881 例患兒進行呼吸道病毒抗原檢測,結果顯示陽性患兒有813 例,病毒類型包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等,與本次研究結果相似。

尋找一種可以對上呼吸道感染早期快速準確診斷的方法不但可以對疾病進行有效診斷,而且可以為臨床治療方案的制定提供指導,有利于臨床選擇針對性抗病毒治療藥物,對于減少臨床抗生素濫用情況具有重要意義。目前上呼吸道病毒感染檢測方法較多,包括電鏡檢測病毒顆粒、病毒培養、病毒核酸檢測、酶聯免疫法等,但均存在不足。作為傳統檢測方法,電鏡檢測病毒顆粒檢測時間較長且陽性率低；病毒培養需要花費較長時間,延誤了診斷治療時間,而且需要較高的培養環境,培養難度高,容易出現假陰性的情況；病毒核酸檢測有較高的靈敏度,但提取相較復雜,在檢測過程中容易造成污染,嚴重影響檢測結果準確性,同時對技術和實驗室具有較高要求；酶聯免疫法檢測病毒抗體檢測結果的時效性較差,對于臨床診斷意義 較小［9,10］。而臨床進行特異性免疫球蛋白G(IgG)陽性檢測只能對患兒既往病毒感染情況進行了解,對于患兒早期感染的判斷和臨床療效的評估意義并不大,IgM抗體雖然敏感性較強,但是對于免疫反應較弱的患兒假陰性發生率較高［11］。相較于抗體檢測,抗原檢測敏感性更強。免疫熒光技術如今已經在臨床廣泛應用,其不但操作簡單和取材方便,對患兒配合度依賴性不大,而且可以進行快速檢驗,經濟性高,同時適用于基層衛生單位和兒童檢驗［12］。345 例檢出病毒抗原陽性,陽性檢出率為86.25%,同時也有效鑒別了病毒類型,表明在小兒上呼吸道疾病微生物快速檢驗中,免疫熒光法陽性檢出率較高,而且可以對病毒類型進行鑒定,有利于臨床對疾病進行診斷,還能為臨床抗病毒治療合理選擇提供科學和可靠依據。本次研究中,345 例 病毒抗原檢出陽性患兒中,1～6 個月、7～12 個月、13～24 個月和＞24 個月患兒占比分別為46.38%、27.54%、14.49%和11.59%,其中1～6 個月患兒占比明顯高于其他年齡段。該結果出現的原因可能與低齡患兒母體抗體減少和免疫球蛋白水平低有關。研究結果還顯示小兒上呼吸道病毒感染呈現出季節性特點,病毒感染主要集中于春冬季,夏秋季少發,其中流感病毒主要集中在冬季,副流感病毒集中在春季。對小兒上呼吸道感染季節性特點進行分析有利于臨床對患兒的發病特征和疾病類型進行診斷。

綜上所述,免疫熒光法操作簡單、經濟性和重復性高,在小兒上呼吸道疾病微生物快速檢驗中應用效果確切,可快速準確檢出感染病毒,對病毒類型進行有效鑒別,有利于臨床對患兒早期感染進行判斷,不但可以指導臨床抗病毒治療的合理選擇,而且對于治療效果的評估和減少臨床濫用抗生素現象有積極意義,值得推廣應用。由于此次研究時間緊張、試劑材料等原因,鼻病毒檢測未能納入分析比較,研究存在一定局限,需要在以后的研究中進一步探討。