大葉落地生根KdSRG1基因的克隆、表達(dá)分析及自激活檢測(cè)

摘要：為探究大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）中衰老相關(guān)基因1（Senescence-related gene 1，SRG1）的功能，以野生型大葉落地生根為材料，克隆KdSRG1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)分析。結(jié)果表明：KdSRG1基因開放閱讀框?yàn)?19 bp，編碼72個(gè)氨基酸；KdSRG1蛋白是一個(gè)親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，并且具有物種上的特異性；該基因在大葉落地生根的不定芽和葉中的相對(duì)表達(dá)量較高，說(shuō)明其參與不定芽和葉的生長(zhǎng)調(diào)控；通過(guò)分析其啟動(dòng)子順式作用元件，推測(cè)KdSRG1基因參與植物分生組織表達(dá)和柵欄細(xì)胞分化過(guò)程，并且其表達(dá)可能受光信號(hào)、脫落酸（Abscisic acid，ABA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）調(diào)控，同時(shí)可能在植物逆境脅迫調(diào)控方面發(fā)揮作用；自激活檢測(cè)表明KdSRG1蛋白沒有自激活活性，可用于后續(xù)的酵母雙雜實(shí)驗(yàn)。本研究為進(jìn)一步研究KdSRG1基因的作用機(jī)制及功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大葉落地生根；KdSRG1基因；基因克隆；亞細(xì)胞定位；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）05-1349-10

Cloning，Expression Analysis and Self-activation Detection of KdSRG1

Gene from Kalanchoe daigremontiana

LUAN Ya-lin， PAN Jia-ni， WANG Meng-di， LI Yin-rui-zhi， ZENG Hui-ming

（School of Grassland Science， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

Abstract：In order to explore the functions of the senescence-related gene （SRG1） in Kalanchoe daigremontiana，the gene of KdSRG1 was cloned from the wild-type K daigremontiana，and then analyzed for its bioinformatics，subcellular localization，and gene expression analysis. The results showed that the open reading frame of KdSRG1 was 219 bp in length，encoding a peptide of 72 amino acids. The KdSRG1 protein is a hydrophilic unstable acidic protein，which was localized in the nucleus and the cell membrane，and had no transmembrane structures or signal peptides and species specific in property. The relative expression of KdSRG1 gene in K. daigremontiana was higher in its plantlets and leave than that in the roots and stems，which demonstrated that gene may be involved in the regulation of adventitious bud and leaf growth. By analyzing the cis-acting elements of KdSRG1 promoter，it was speculated that KdSRG1 gene would take a role in that plant meristem formation and palisade mesophyll cells differentiation，and the expression of this gene may be regulated by light signal，abscisic acid （ABA），and methyl jasmonate （MeJA）. Moreover，the KdSRG1 gene may play a role in that plant stress regulation. The self-activation detection showed that KdSRG1 protein had no self-activation activity and could be used to the subsequent yeast two-hybrid experiments. This study could be used for further research on the functional mechanisms of KdSRG1 gene.

Key words：Kalanchoe daigremontiana;KdSRG1 gene;Gene cloning;Subcellular localization;Expression analysis

作為廣泛存在于生物體中的氧化還原酶之一，α-酮戊二酸/Fe（II）依賴雙加氧酶（2-oxoglutarate/Fe（II）-dependent dioxygenase，2-ODD）具有重要的生物學(xué)作用。2-ODD超家族極其龐大，是植物體內(nèi)的第二大酶家族，其通過(guò)催化氧化反應(yīng)合成多種代謝物［1-2］。2-ODD的催化過(guò)程是以α-酮戊二酸（2-oxoglutarate，2OG）和O₂為共底物，F(xiàn)e²⁺為輔因子來(lái)催化底物氧化，同時(shí)2OG脫羧形成CO₂和琥珀酸［3］。就底物和產(chǎn)物的選擇性而言，2-ODD是最具有生化活性的酶之一［4］。

在植物中，廣泛的生物學(xué)過(guò)程都有2-ODD的參與，包括DNA去甲基化、脯氨酸羥基化和植物激素生物合成等［1］。其中，植物激素的生物合成對(duì)于農(nóng)作物來(lái)說(shuō)具有重要意義，因此大部分相關(guān)研究集中在這一方面。研究發(fā)現(xiàn)，2-ODD參與植物中類黃酮、赤霉素和乙烯的合成途徑［6］。2-ODD超家族中，GAI4基因參與赤霉素的合成，并且在種子萌發(fā)過(guò)程中起重要作用［7］；MdCo31基因高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源GA1減少，從而使植物出現(xiàn)矮化表型［8］；OsFLS基因同時(shí)具有黃酮醇合成酶和黃烷酮3-羥化酶的活性，可以催化黃烷酮和二氫黃酮醇的互相轉(zhuǎn)化，是一種雙功能的2-ODD酶［9］。此外，2-ODD在植物中的其他功能也得到充分研究，如在陸地棉（Gossypium hirsutum L.）和日本晴水稻（Oryza sativa L. ssp. japonica）中響應(yīng)干旱脅迫［9-10］，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中影響植物防御機(jī)制［11］，在水稻（Oryza sativa L.）中影響卷葉性狀［12］。因此，2-ODD不僅在植物的生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮重要作用，而且其參與合成的次生代謝物具有極高的藥用價(jià)值［13］。

大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）是景天科（Crassulaceae）伽藍(lán)菜屬（Kalanchoe）的一種多年生肉質(zhì)草本植物，原產(chǎn)于非洲馬達(dá)加斯加，屬于營(yíng)養(yǎng)體胎生植物類型［14］。在大葉落地生根中提取的天然化合物具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲的作用［15-16］。大葉落地生根的不定芽在葉緣粗齒處呈對(duì)稱生長(zhǎng)并在合適條件下形成完整植株，體現(xiàn)了典型的植物體細(xì)胞全能性，并且其不定芽的發(fā)育過(guò)程同時(shí)具有細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑，是研究植物無(wú)性繁殖的理想模型［17］。此外，大葉落地生根也是景天酸代謝（Crassulacean acid metabolism，CAM）途徑的模式植物，并以此途徑進(jìn)行光合作用［18］。衰老相關(guān)基因1（Senescence-related gene 1，SRG1）所編碼的蛋白具有2-ODD結(jié)構(gòu)域，屬于2-ODD超家族。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，有關(guān)2-ODD的研究越來(lái)越廣泛和深入，但有關(guān)大葉落地生根KdSRG1基因的研究未見報(bào)道。本研究通過(guò)克隆大葉落地生根KdSRG1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、自激活檢測(cè)、亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)分析，初步探討了KdSRG1的功能，為深入研究該基因的作用機(jī)制及功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為野生型大葉落地生根，種植于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所人工氣候箱中，基質(zhì)為蛭石、草炭、珍珠巖，其體積比為1∶1∶1，光周期為14 h /10 h（日／夜），溫度為26℃，濕度為60%。本氏煙草（Nicotiana benthamiana Domin.）、根癌農(nóng)桿菌EHA105、酵母菌株Y2HGold、酵母雙雜交載體pGBKT7均為本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京全式金公司。DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、純化試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司。克隆載體pMD19-T、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶Nco I、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、DL5000 DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。無(wú)縫連接酶購(gòu)自碧云天公司。實(shí)驗(yàn)所用引物（表1）利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并通過(guò)北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因克隆以大葉落地生根cDNA為模板，KdSRG1-F和KdSRG1-R為引物，利用2×GoldStar best MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化后與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取大小均一的單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取單一條帶且長(zhǎng)度符合要求的菌液送至生物公司測(cè)序。

1.2.2生物信息學(xué)分析通過(guò)NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找KdSRG1同源蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，并用MEGA 11構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，方法采用鄰接法，校驗(yàn)參數(shù)bootstrap設(shè)置為1 000。使用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)的ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam）和SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分別對(duì)蛋白一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性進(jìn)行分析；使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的特性進(jìn)行分析。利用TMHMM Server V2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)。利用iPSORT（https：//www.genscript.com/psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。通過(guò)SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預(yù)測(cè)目的基因信號(hào)肽。通過(guò)ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的疏水性和親水性。

1.2.3啟動(dòng)子順式作用元件分析為了進(jìn)一步了解大葉落地生根KdSRG1的功能，通過(guò)染色體步移法獲得其上游1 427 bp的啟動(dòng)子序列。利用在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)KdSRG1上游的啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.4pGBKT7-KdSRG1誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建提取測(cè)序正確的菌液的質(zhì)粒，命名為pMD19-T-KdSRG1，并以其為模板，KdSRG1-BD-F和KdSRG1-BD-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用限制性內(nèi)切酶Nco Ⅰ對(duì)pGBKT7載體進(jìn)行酶切處理，對(duì)PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用通過(guò)In-Fusion連接酶將兩個(gè)產(chǎn)物連接。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，均勻涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取大小均一的單克隆菌落，以T7和3′BD為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取長(zhǎng)度符合要求的菌液送至生物公司測(cè)序。

1.2.5酵母轉(zhuǎn)化及自激活檢測(cè)將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，將其命名為pGBKT7-KdSRG1。醋酸鋰轉(zhuǎn)化法制備Y2HGold酵母感受態(tài)，并將pGBKT7-KdSRG1和pGBKT7空載體轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于SD/-Trp平板上，置于30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并酵母去壁，進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取長(zhǎng)度符合要求的菌液送至生物公司測(cè)序。

將成功轉(zhuǎn)入pGBKT7-KdSRG1和pGBKT7空載體的酵母單克隆菌落置于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液分別稀釋至1/10，1/100，1/1 000，并分別取10 μL接種于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上。置于30℃下倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察其生長(zhǎng)狀況和顏色。

1.2.6亞細(xì)胞定位以pMD19-T-KdSRG1為模板，KdSRG1-3302Y-F和KdSRG1-3302Y-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建35S：：KdSRG1-GFP表達(dá)載體，并以35S：：GFP為對(duì)照空載體，將其轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，注射煙草葉片并置于黑暗條件中培養(yǎng)48 h。通過(guò)共聚焦顯微鏡（Leica，SP-8）觀察葉片細(xì)胞中GFP信號(hào)的分布情況。

1.2.7表達(dá)分析選取生長(zhǎng)狀況良好并且成熟的大葉落地生根的根、莖、葉、不定芽組織，分別進(jìn)行RNA提取，之后對(duì)其進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察18S和28S條帶。將完整性較好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板，大葉落地生根Kd-actin基因內(nèi)參，KdSRG1-RT-F和KdSRG1-RT-R為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA1 μL，ddH2O 7 μL。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-△△CT法分析結(jié)果，通過(guò)Microsoft Excel 2019進(jìn)行計(jì)算和圖表繪制，并采用SPSS 25.0進(jìn)行差異顯著性分析（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1基因克隆以大葉落地生根第一鏈cDNA為模板，KdSRG1-F和KdSRG1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)純化并與pMD19-T載體連接，電泳檢測(cè)后可見大小約為500 bp單一條帶（圖1）。將上述菌液送至生物公司，測(cè)序結(jié)果正確，表明成功克隆KdSRG1基因。

2.2生物信息學(xué)分析KdSRG1基因開放閱讀框共219 bp，編碼72個(gè)氨基酸（圖2）。其正電荷氨基酸殘基數(shù)量為10，負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)量為11，分子式為C₃₄₇H₅₇₀N₁₀₀O₁₁₄S₆，蛋白分子質(zhì)量為8 159.30 Da，理論等電點(diǎn)為5.76；脂溶系數(shù)為71.81，不穩(wěn)定系數(shù)為58.55。蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析（圖3）表明，第20位的蘇氨酸親水性最強(qiáng)，分值為-2.967，第54位的丙氨酸疏水性最強(qiáng)，分值為1.522。從整體來(lái)看，親水區(qū)域面積大于疏水區(qū)域，且含有一個(gè)絕對(duì)分值大于2的強(qiáng)親水區(qū)域。因此，KdSRG1蛋白是一個(gè)親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4A）及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖4B）表明，該蛋白由4種結(jié)構(gòu)元件組成，其中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲均為41.67%，延伸鏈12.50%，β-轉(zhuǎn)角為4.17%。KdSRG1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)，并且不含有信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白定位在細(xì)胞核的可能性最大。通過(guò)MEGA 11以鄰接法構(gòu)建KdSRG1蛋白與其他物種SRG1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果表明KdSRG1蛋白與其他物種SRG1蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，具有物種上的特異性。

2.3KdSRG1啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析為了探究KdSRG1基因的功能，通過(guò)染色體步移法獲取KdSRG1基因上游1 427 bp的啟動(dòng)子序列，并使用PlantCARE對(duì)其進(jìn)行分析。啟動(dòng)子的順式作用元件分析（表2）結(jié)果表明，KdSRG1啟動(dòng)子中除了含有核心啟動(dòng)子元件TATA-box，CAAT-box和A-box以外，其他的順式作用元件主要分為4類，分別是光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件和植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件。該啟動(dòng)子中存在多種光響應(yīng)元件，暗示其具有多種方式響應(yīng)光信號(hào)。由此推測(cè)，該啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下游的KdSRG1基因，可能在光響應(yīng)和脫落酸（Abscisic acid，ABA）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）響應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，并且調(diào)控其參與分生組織表達(dá)和柵欄細(xì)胞分化過(guò)程，同時(shí)逆境脅迫響應(yīng)元件的存在可能會(huì)增強(qiáng)植物抗逆性。

2.4表達(dá)載體的構(gòu)建以pMD19-T-KdSRG1為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與pGBKT7載體純化連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，可見約500 bp的單一條帶（圖6）。上述菌液送至生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建含KdSRG1基因的誘餌表達(dá)載體，命名為pGBKT7-KdSRG1。

2.5誘餌表達(dá)載體的自激活檢測(cè)將成功轉(zhuǎn)化的酵母單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并稀釋后，接種于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上，觀察酵母菌生長(zhǎng)情況。酵母自激活檢測(cè)（圖7）結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入pGBKT7-KdSRG1和pGBKT7空載體的酵母菌在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且不顯示藍(lán)色，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受到抑制且不顯示藍(lán)色，說(shuō)明KdSRG1基因不具自激活活性。

2.6亞細(xì)胞定位蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位決定了其行使功能的部位，因此蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位與其功能密切相關(guān)。為研究KdSRG1蛋白在細(xì)胞中的定位情況，將成功轉(zhuǎn)入35S：：KdSRG1-GFP和35S：：GFP重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液注射本氏煙草葉片的背面，黑暗條件下培養(yǎng)48 h，并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白的分布情況。亞細(xì)胞定位結(jié)果（圖8）顯示，在煙草葉片細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒35S：：GFP對(duì)照空載體的熒光信號(hào)分布整個(gè)細(xì)胞中，而轉(zhuǎn)化質(zhì)粒35S：：KdSRG1-GFP表達(dá)載體的熒光信號(hào)均分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表明KdSRG1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)。

2.7表達(dá)分析為了研究大葉落地生根KdSRG1基因在不同組織的表達(dá)情況，提取成熟大葉落地生根的根、莖、葉、不定芽組織RNA，并對(duì)其進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果（圖9A）表明，28S和18S條帶完整明亮，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，表明RNA完整性較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板，大葉落地生根Kd-actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。分析結(jié)果（圖9B）表明，KdSRG1基因在根、莖、葉、不定芽中均有表達(dá)但相對(duì)表達(dá)量存在差異，不定芽和葉中相對(duì)表達(dá)量顯著高于在根和莖中的相對(duì)表達(dá)量，推測(cè)該基因可能參與不定芽和葉的生長(zhǎng)調(diào)控。

3討論

2-ODD家族基因的保守性為19%～75%，保守性上具有一定差異，因此不同的2-ODD蛋白具有不同的生物活性［19］。本研究成功克隆KdSRG1基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析初步預(yù)測(cè)其功能。KdSRG1基因開放閱讀框219 bp，編碼72個(gè)氨基酸殘基，其理化性質(zhì)分析表明，KdSRG1蛋白為親水性的酸性蛋白，具有較強(qiáng)的親水性。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，大葉落地生根中的KdSRG1蛋白具有物種上的特異性。亞細(xì)胞定位顯示大葉落地生根KdSRG1蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，表明其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上行使功能。熒光定量結(jié)果表明，KdSRG1基因在大葉落地生根的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但各個(gè)組織中相對(duì)表達(dá)量不同（不定芽＞葉＞根＞莖）。該基因在不定芽和葉中的相對(duì)表達(dá)量較高，具有組織差異性表達(dá)，可能參與大葉落地生根不定芽和葉的發(fā)育調(diào)控。

啟動(dòng)子能調(diào)控下游基因的特異表達(dá)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心組成部分。植物在遭受逆境脅迫時(shí)，啟動(dòng)子能夠調(diào)控脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，具有重要的地位［20］。通過(guò)啟動(dòng)子的順式作用元件預(yù)測(cè)，可以初步分析基因的表達(dá)機(jī)制及功能。KdSRG1啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析顯示，該啟動(dòng)子除了含有核心啟動(dòng)子元件TTATA-box，CAAT-box和A-box以外，還含有光響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)響應(yīng)元件和柵欄細(xì)胞分化響應(yīng)元件等。光可以作為環(huán)境信號(hào)來(lái)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［21］。KdSRG1啟動(dòng)子含有多個(gè)光相應(yīng)元件，暗示該基因可能通過(guò)多種方式參與植株的光調(diào)控途徑。崔澤田等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在甘蔗（Saccharum spontaneum L.）中，大部分2-ODD加氧酶基因家族成員的啟動(dòng)子均含有ABA響應(yīng)元件ABRE、茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，這與KdSRG1啟動(dòng)子中的激素響應(yīng)元件相同。ABA和茉莉酸類物質(zhì)可以調(diào)控植物的一些生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，對(duì)植物抗逆性有十分重要的意義［23-24］。因此，推測(cè)KdSRG1基因調(diào)控植物分生組織表達(dá)和柵欄細(xì)胞分化過(guò)程，并且其表達(dá)可能與光信號(hào)、ABA和MeJA有關(guān)，同時(shí)可能在植物逆境脅迫調(diào)控方面發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)成部分細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而在生命體的生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用，探究蛋白質(zhì)互作能夠加深對(duì)細(xì)胞分子機(jī)制的認(rèn)知。酵母雙雜交技術(shù)是鑒定或者篩選蛋白質(zhì)互作的常規(guī)方法之一，這種技術(shù)利用酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)特征，具有廣泛適用性和巨大的潛力［25-26］。此技術(shù)具有敏感性強(qiáng)和效率高等優(yōu)點(diǎn)，并且可以篩選cDNA文庫(kù)識(shí)別互作蛋白，通過(guò)對(duì)編碼目的蛋白的cDNA進(jìn)行操作，從而簡(jiǎn)化下游研究，因此得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［26-27］。本研究通過(guò)克隆大葉落地生根KdSRG1基因，構(gòu)建pGBKT7-KdSRG1誘餌表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行自激活檢測(cè)表明其無(wú)自激活活性，可用于后續(xù)的篩選互作蛋白實(shí)驗(yàn)。本項(xiàng)目組將進(jìn)行互作蛋白篩選實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行噴施外源ABA和MeJA等進(jìn)行外施激素等表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步解釋KdSRG1基因調(diào)控的分子機(jī)制。本研究為深入探究KdSRG1基因的功能奠定了基礎(chǔ)，但關(guān)于其在大葉落地生根中的具體功能及調(diào)控機(jī)制還需要深入研究。

4結(jié)論

本研究成功克隆大葉落地生根KdSRG1基因。該基因的啟動(dòng)子含有光響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)響應(yīng)元件和ABA響應(yīng)元件等，暗示該基因可能在植物的光調(diào)控和逆境脅迫調(diào)控方面發(fā)揮作用。KdSRG1基因在不定芽和葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在根和莖中的相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明其參與不定芽和葉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。KdSRG1蛋白為親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白，無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上發(fā)揮作用，并且具有物種上的特異性。酵母轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白不具備自激活活性，可用于后續(xù)的酵母雙雜實(shí)驗(yàn)篩選互作蛋白。本研究為進(jìn)一步探究KdSRG1基因奠定了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）