CRISPR十年：基因編輯技術初露鋒芒

正如CRISPR基因組編輯技術的誕生時刻，科學家的好奇心和造福社會的愿望將會推動CRISPR技術未來十年的創新發展。

分子生物學、遺傳學和基因組學正處于關鍵時刻——歷史積累的知識和方法能夠在技術上實現有效編輯細胞和活有機體DNA的特定堿基對或片段。一個新時代儼然到來：規律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）基因編輯技術聯合不斷提升的計算機和成像水平，能夠精確診斷疾病并基于個體基因組預測疾病易感性，甚至能夠改造遺傳信息。該技術同樣能夠鑒定和快速改造植物性狀的基因，加快農業研究和植物育種的速度。技術的結合影響深遠，而這一切僅僅是初露鋒芒。在CRISPR-Cas9作為基因編輯技術誕生的十年中，CRISPR工具箱使生物學研究發生了天翻地覆的變化，在造福遺傳病患者的同時，還改變了農業的運作方式和農產品。作為CRISPR技術應用的典范，基因組醫學領域能夠在24小時內獲得人類基因組的完整序列——相比破解第一個人類基因組序列花費了五年，這一進步令人驚嘆。在此之前，在基因組中設計并寫入臨床上有效的信息幾乎是天方夜譚，而現在利用強大的CRISPR基因組編輯器只需要花費幾天時間。

過去十年中，RNA編程的基因組編輯技術橫空出世，在許多領域中經基因工程設計并廣泛應用。CRISPR-Cas9的基礎功能是在基因或基因調控元件中敲除目標基因，科學家基于此搭建技術平臺，實現快速制造基因敲除的小鼠和其他動物模型、遺傳篩選和多重基因編輯。除了常規的CRISPR-Cas9誘導基因敲除外，堿基編輯則能夠在位點生成特定而精確的點突變，利用基因工程設計的Cas9與酶融合改變了DNA堿基的化學本質。過去十年中，CRISPR技術已經在科學家手中成為適用性很高的工具，廣泛用于研究生物功能、解析基因相互作用，以及對抗人類疾病和生產基因工程作物。本綜述追溯CRISPR基因編輯技術從誕生到成功應用的發展歷程，探討目前面臨的緊迫挑戰，包括如何提升編輯的準確性和精確性、實現基因序列的精確可編程插入、促進CRISPR編輯器的靶向遞送，以及增加技術的可得性和可負擔性。我們討論這些問題的現狀，包括新興的基因插入技術和全新的遞送形式，描繪未來所需的創新和基因工程方向。本綜述例證CRISPR基因組編輯器在醫藥和農業領域的廣泛應用，包括基于CRISPR的鐮狀細胞病療法、營養更好的CRISPR編輯番茄，以及產量高的CRISPR編輯抗病小麥，討論CRISPR現狀和未來的潛在社會影響。

未來十年，基因組編輯研究和應用的領域將會進一步拓展，與機器學習、活細胞成像和測序等技術進步相互交織。新發現將會拓展和優化CRISPR工具箱，以應對目前各種挑戰，并在基礎和應用研究中發揮廣泛作用。正如CRISPR基因組編輯技術的誕生時刻，科學家的好奇心和造福社會的愿望將會推動CRISPR技術未來十年的創新發展。

本綜述討論CRISPR基因操縱技術在人類、動物和植物中應用的現狀，聚焦該技術的成果和挑戰，并展望未來技術路徑。

這項技術的起點可以追溯到1987年，當時一篇文章報道了細菌基因組中的重復DNA序列，而一些微生物學和食品科學研究者開始對此展開研究。這一神秘的DNA序列被稱作規律間隔成簇短回文重復序列，通常與編碼CRISPR相關蛋白（Cas）的序列一同出現在微生物基因組中。研究者發現CRISPR中的短DNA序列與病毒中的匹配，提示該系統可能是一種適應性免疫途徑，用于抵御病毒感染（圖2A）。隨后，好奇的研究者進一步發現，CRISPR系統利用這一序列陣列轉錄得到RNA分子，引導Cas蛋白進行剪切破壞病毒的DNA或RNA。進一步的研究還發現，CRISPR的RNA編程剪切能力能夠以前所未有的簡便方式改變任意細胞的DNA序列。在過去十年中，全球的科學家迅速接納了CRISPR方法，廣泛運用于動物、植物和人類的基礎研究和應用領域。

CRISPR-Cas9蛋白及其搭檔RNA的復合物是目前應用最廣泛的基因組編輯器（圖2B）。CRISPR能夠通過RNA導向識別DNA的特定序列，進行剪切并產生DNA斷裂，是其用于基因組編輯的關鍵機制。同時由于真核細胞具有高效修復DNA斷裂的能力，因此可以根據需要隨意改變DNA序列。Cas蛋白利用RNA-DNA堿基配對來識別DNA，以Cas9為例，同一蛋白可以通過簡單替換向導RNA來靶向廣泛的DNA序列。在Cas9活性位點中改變剪切行為的目標氨基酸，就能夠實現所需的DNA切口（nicking，即剪切單鏈DNA得到的切口），或通過無催化活性的Cas9實現DNA結合。這樣，第一批基因工程CRISPR-Cas系統應運而生，通過轉錄的抑制或激活實現特定基因的沉默或上調。通過基因工程設計不同的Cas9和酶結合后，便可以實現個體堿基編輯、核染色質改造或基因序列插入。此外，研究者還基于大量生物化學和結構解析的研究結果，探索了其他一些Cas蛋白，這些蛋白能夠靶向RNA改造基因組。其中，部分酶還被用于開發成像技術和診斷方法。

綜合以上方法，研究者以CRISPR技術為基礎開展了一系列臨床試驗，用于治療鐮狀細胞病、β-地中海貧血、退行性疾病轉甲狀腺素蛋白（TTR）淀粉樣變性和先天性眼病，同時也嘗試罕見病（如兒童早老癥、重癥聯合免疫缺陷病及家族性高膽固醇血癥）和常見病（如癌癥和HIV感染）的新療法。此外，CRISPR技術還推動農業技術進步，包括生產光滑皮毛表型的基因編輯牛和營養價值更高的番茄。CRISPR為分子和細胞生物學領域注入動力，為數以千計的研究論文提供基礎，為許多醫學、農業及合成生物學公司提供工具。即便如此，目前的CRISPR技術僅僅是初露鋒芒。本文將繼續在下一章節討論一些如今已經常規應用的基因編輯技術，以及一些由于技術限制而具有挑戰性的方法。這些基因編輯的技術挑戰將通過日益完善的基因操縱工具箱得到解決，從而為這些領域的新發現和基因工程進步提供機會。

CRISPR誘導的基因敲除

過去十年中，CRISPR誘導的基因敲除技術在世人的震驚下橫空出世，徹底改變了基礎和轉化研究，并在農業和醫學中展現出巨大潛力。經典的真核細胞CRISPR誘導敲除方法采用CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP），它由Cas9核酸酶和基因工程設計的單鏈向導RNA（sgRNA）組成。sgRNA將Cas9引導至目標位點，從而引起DNA雙鏈斷裂（DSB）。該斷裂繼而被內源性修復途徑修復，包括非同源性末端接合（NHEJ）和微同源介導的末端接合（MMEJ）途徑，以及利用修復模板進行的同源介導的更精細雙鏈DNA修復（HDR）途徑（圖3A）。由于CRISPR-Cas9的靶向特異性和效力方面表現出色，這種基因敲除技術已常規應用于研究領域，為敲除基因進行功能研究提供了簡便流程。

CRISPR-Cas9成功實現了快速制造基因敲除（KO）小鼠和其他動物模型（圖3B）。傳統的基因靶向技術首先進行效率不高的胚胎干（ES）細胞同源重組，接著對經改造的ES細胞進行耗時費力的篩選得到所需的變化序列，最后注射進野生型（WT）胚胎。CRISPR-Cas9則在單細胞階段胚胎產生DSB，避免篩選目標ES細胞的階段，大大簡化了基因編輯動物的生產流程。利用CRISPR-Cas9技術，制造基因改造小鼠所需的時間從一年縮減至四周。由此，如今的科學研究中往往會常規制造KO和轉基因小鼠。此外，由于大多數哺乳動物缺乏建立成熟的ES細胞系，CRISPR-Cas9編輯技術也能夠幫助開發新物種的基因編輯動物模型。隨著CRISPR-Cas9組件引入受精卵策略的不斷進步，研究者能夠更高效地開發KO和轉基因動物模型，例如通過受精卵CRISPR RNP電穿孔技術（CRISPR-EZ）、CRISPR RNP電穿孔和腺相關病毒供體感染技術（CRISPR-READI），以及通過輸卵管遞送核酸的優化基因組編輯技術（i-GONAD）等新策略。除了編輯生殖細胞系外，CRISPR-Cas9也能夠編輯體細胞，特別適用于全身基因敲除會導致胚胎死亡，或需要對癌癥進展進行精確造模并模擬真實治療方法的研究。活體遞送策略的進步擴充了體細胞動物模型的種類。CRISPR基因組編輯方法能夠制造許多疾病的動物模型，包括酪氨酸血癥、杜氏肌營養不良癥、癌癥、骨質疏松癥、亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、阿爾茨海默病和艾滋病病毒1型艾滋病等。高效的動物造模極大地推進了遺傳病研究，研究者能夠深入探究特定遺傳變異與疾病之間的因果關聯，從而開發并測試新的療法。

CRISPR篩選

由于CRISPR誘導基因敲除相當便利，研究者已經成功利用這項技術進行遺傳篩選（即并行對多個基因開展系統性的遺傳改造）。這種CRISPR篩選有利于理解遺傳相互作用和解析生物學通路，從而推動發現治療靶點并開發藥物。CRISPR篩選的能力正不斷增強，特別是在與單細胞多組學技術進步的結合后。遺傳篩選通常涉及一個或多個基因擾動、一個模式系統（如基因工程人類細胞），以及一種篩選實驗或生物信息讀取手段以夠評估基因擾動的效果（圖3C）。由于CRISPR編輯效率高、靈活性好，是引入基因擾動的強大策略，可用于精細研究敲除單個基因對特定細胞的影響，以及在合并篩選中對大量基因擾動進行高通量測定。由于目前設計并克隆向導RNA（gRNA）相對容易，研究者得以成功構建基因組水平的gRNA文庫，從而能夠擾亂人類基因組中的所有基因。CRISPR技術進步也拓展了CRISPR篩選方案的種類，實現各種功能。除了CRISPR KO的篩選方法，熱門方法還包括CRISPR干擾（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）篩選，利用可逆基因表達控制手段進行篩選。飽和式基因組編輯則利用Cas9介導HDR，能夠生成任意可能的單核苷酸多態性（SNP）用于功能篩選。近來，研究者嘗試利用CRISPR堿基編輯和先導編輯替代Cas9介導HDR進行基因篩選。堿基編輯相對Cas9介導HDR能夠高效引入點突變，減少得失位形成，或將成為功能多樣性篩選的更優策略。先導編輯則插入和刪除包含點突變的小片段，在殘基中實現飽和突變。先導編輯這項新技術還需要進一步測試，目前并不明確其在靶向目標和窗寬的靈活性上能否達到HDR的水平。

CRISPR技術能夠成功編輯多種細胞和有機體，這意味著遺傳篩選研究中能夠靈活選擇最優的模型系統。除了初級細胞生物外，研究者還在不斷開發CRISPR篩選技術，用于更復雜模型系統中，如類器官、動物和植物。CRISPR篩選已成為探究癌癥中基因功能的常規方法，已經成功鑒定一系列癌癥的驅動和調節基因。

將CRISPR組件引入生物模型后，可用各類技術進行篩選實驗和生物信息讀取。常規篩選策略包括基于生存或生殖能力檢測、利用細胞表面蛋白（如PD1、PDL1和MHC）作為標記的熒光激活細胞分選或微流控輔助分選，以及在體表型分析，如腫瘤生長或對免疫療法敏感或抵抗。CRISPR篩選中用于讀取生物信息的新技術，包括Procode、Perturb-ATAC、Perturb-seq和ECCITE-seq，能夠同步提供蛋白組學、表觀遺傳學和/或轉錄組學分析等大量有價值的信息。CRISPR篩選技術將會繼續加速發展，提高實驗和生物信息讀取的敏感性。目前的研究成果還只是CRISPR篩選和單細胞多組學與大數據采集和分析建設系統的初步結合。未來隨著進一步的發現和基因工程技術進步，直系同源Cas9酶或Cas12a等其他RNA導向核酸酶的功能增強，同樣將極大增加組合或多重CRISPR篩選的潛能，從而揭示新的和復雜的遺傳交互作用。

多重基因編輯在植物和其他生物中的應用

多重基因編輯能夠同步靶向基因組中多個特定DNA位點，代表CRISPR誘導基因敲除技術成功拓展并適應于其他學科領域，尤其是植物科學（圖3D）。在過去十年間，CRISPR-Cas9成為植物基因編輯的熱門工具。傳統作物性狀的基因工程方法主要包括隨機誘變（如利用輻射）或利用農桿菌進行轉基因，然后通過耗時費力的雜交和篩選鑒定出具有目標新性狀的植物。這些方法耗時較長，控制較難，同時存在監管問題。而CRISPR誘導基因改造則靶向明確、效率很高，且在性狀的基因工程位點中產生較少的得失位（基因插入和/或刪除）或點突變。CRISPR-Cas9可同步進行多位點編輯，靶向多個不同基因，這對于編輯攜帶多份目標基因拷貝的作物類（如六倍體小麥）以及涉及多個不同靶向基因的作物馴化而言尤其有用。CRISPR-Cas9多重編輯的一個優點在于能夠分離核酸酶和gRNA，由此一個Cas蛋白能夠利用多個gRNA編輯不同目標。gRNA能夠作為多個個體基因表達的工具盒插入，通過各自的啟動子被轉錄，也可作為轉錄后的單個多順反子的工具盒插入。在過去數年中，CRISPR多重基因組編輯技術已經在植物學科領域大獲成功，用于制造新作物基因表型和在單一代作物中制造農業上有用的表型。多重CRISPR-Cas9編輯大放異彩的領域之一便是用于作物馴化和增強。其中包括利用多重編輯技術干擾馴化基因、引入耐除草劑基因，以及增加作物產量和提高品質。

多重CRISPR-Cas9編輯在植物之外的細胞種類和有機體中也得到了應用。一個值得關注的例子是利用多重編輯技術制造豬內源性逆轉錄病毒滅活豬，以此解決豬器官移植給人類的安全性問題。此外，多重編輯有潛能用于基因工程制造癌癥的細胞療法產品，以及研究復雜的多基因病。但在哺乳動物細胞中進行CRISPR-Cas9編輯還存在一些問題，尤其是多重編輯中同步進行DNA剪切可能會誘發轉錄因子p53介導的DNA損傷反應機制，導致細胞衰老或凋亡。CRISPR精準編輯技術可能會解決這一問題并拓展多重編輯的應用領域，這些避免引入DSB的新技術包括堿基編輯和先導編輯，已經在多重編輯中得到應用。

利用堿基編輯實現位點特異的基因改造

傳統的CRISPR誘導基因敲除技術會產生雙鏈DNA剪切，而堿基編輯技術利用Cas效應器與酶的融合蛋白改變DNA剪輯的化學本質，能夠在不產生DSB的情況下精確產生位點特異的精確點突變，因此無須修復模板，產生更少的編輯副產物（圖3E）。CRISPR

堿基編輯器通常由Cas9切口酶（nCas9，或其他無催化活性或“死”Cas蛋白，如dCas9、dCas12a或dCas13b）和催化核酸堿基脫氨基反應的酶融合而成，其中nCas9是一種Cas9變體，能夠產生單鏈而非雙鏈斷裂。sgRNA作為向導將nCas-脫氨基酶融合物帶至基因組上的目標區域，三者的復合物將單鏈DNA（ssDNA）區域暴露給脫氨基酶并產生化學修飾。產物中的堿基錯配則由細胞修復機制解決。過去數年中，DNA和RNA剪輯編輯器工具箱不斷進步，能夠實現Cgt;T（C替換為T，下同）、Agt;G、Cgt;G、Agt;I和Cgt;U的堿基替換，但還有進一步完善的空間，尤其是Cgt;G的編輯。位點特異的基因改造讓研究者能夠進一步研究基因變異的結果，并能夠通過校正點突變治療遺傳病，這是因為點突變是導致人類致病性遺傳變異的主要原因。堿基編輯還可以在分裂和非分裂細胞中進行基因改造，這優于僅可用于分裂細胞的HDR。堿基編輯在一系列小鼠模型中展現出校正功能缺失突變的可喜結果，有團隊報告通過在體堿基編輯治療小鼠早老癥。堿基編輯技術不斷發展，減少引入DSB，這代表著精確編輯的一大進步。在未來十年，如何優化這些工具的準確性和精確性以用于治療人類遺傳病將會是領域中的一大挑戰。一個利用堿基編輯治療家族性高膽固醇血癥的早期臨床試驗已經開始，另一利用該技術治療鐮狀細胞病的臨床試驗也預定于2023年開始。

編輯準確性和精確性

當我們踏入CRISPR基因組編輯的下一個十年，需要繼續用創新方法解決包括編輯準確性（即特異靶向目標位點的能力）和精確性（即產生目標編輯結果的能力）在內的數個挑戰（圖4A）。為了減少CRISPR-Cas核酸酶因意外結合和剪切而產生脫靶效應，研究者應用各種合理設計和篩選開發了高保真的Cas變體（如SpCas9-HF1、evoCas9、HiFiCas9和Cas9_R63A/Q768A變體），并采用了優化方法（如E-Crisp、CasOFFinder和sgDesigner）。其結果喜人：目前臨床上應用的CRISPR Therapeutics/Vertex和Intellia sgRNAs使用美國食品藥品管理局（FDA）級別的實驗方法，都不存在可測量的脫靶位點。但除了Cas9之外，脫靶編輯的不準確性還存在與效應區域相關的因素，堿基編輯結果分析顯示這些原因包括脫氨基酶、逆轉錄酶和轉錄調節因子。如今研究者在解決這一問題方面取得了一定的進步，他們利用高保真Cas變體以及合理的脫氨基酶區域基因工程設計來減少非Cas輔助的核酸結合，而早期的堿基編輯臨床試驗在這方面帶給研究者一定信心。同時，發明新的Cas編輯器遞送至目標位點的方法，以及優化現有方法也能夠減少脫靶效應。編輯精確性則是更大的挑戰。經典的真核細胞CRISPR-Cas9編輯中，科學家無法完全掌控引入DSB后的編輯結果。近來，新開發的機器學習工具能夠輔助預測修復DSB后的結果，但這一技術還未實現在體應用。DSB后的人類細胞中的默認修復途徑（NHEJ）會和效率相對低的HDR途徑競爭，導致目標位點產生一系列得失位。盡管這對于CRISPR誘導敲除的許多應用（包括臨床應用）而言還可以接受，但許多臨床應用需要更高的精確性，無法承受得失位帶來的風險。提升編輯的精確性需要更好地理解DNA修復進程，并結合創新方法和基因工程設計。一種方法是促進HDR的效率，和/或抑制NHEJ。研究者開發了一系列策略，包括化學抑制NHEJ途徑的關鍵酶、利用單鏈寡脫氧核苷酸模板（在人類細胞單核苷酸替換中能夠將HDR效率提升至60%）、控制細胞周期階段來促進HDR修復，以及利用位點特異的Cas9-寡核苷酸接合物向目標位點招募供體DNA模板。即使運用這些策略，也存在和DSB形成相關的大型刪除和染色體重排風險，這會導致基因組不穩定。堿基編輯和先導編輯技術是避免DSB形成的精確編輯方法，二者相對經典Cas9介導編輯能夠減少得失位的形成。但在一些案例中編輯位點仍然會出現預期外的DSB，并產生得失位。研究顯示通過將堿基編輯器和Gam（一種噬菌體Mu蛋白，能夠和DSB結合）融合，能夠減少堿基編輯時的得失位形成。對于堿基編輯，旁觀者編輯也會影響編輯的精確性，這是指編輯窗寬內或附近的目標堿基外的可編輯堿基（旁觀者）產生了預期外的變換。堿基編輯器的校正精度會因為編輯窗內存在一個或更多目標堿基而大幅下降，這限制了其用作治療方法的潛力（圖4B）。最近的一項研究顯示，大約一半的致病單核苷酸變異（SNV）通過腺嘌呤剪輯編輯器校正，能夠達到≥50%的校正精度。但是當部分SNV在編輯窗中包含超過1個目標堿基時，其≥50%的校正精度就會下降到26%。然而目前的剪輯編輯器常常發生旁觀者編輯。最近一項研究納入了21個不同的堿基編輯系統，發現大約有一半的可靶向致病點突變在這些編輯系統的編輯窗內存在旁觀者。縮小編輯窗寬能夠增加精確性，但PAM約束會限制可靶向的基因位點。許多策略使用結構導向的變異發生、定向進化和計算機輔助設計，以增加CRISPR-Cas9的可靶向范圍，減少堿基編輯器的旁觀者效應。如果希望將堿基編輯作為有效策略廣泛應用，就需要基于目前的策略進一步進行基因工程設計，在不妥協效率和靶向特異性的條件下開發具有更小編輯窗和更廣PAM適用性的堿基編輯器。

基因序列插入

近年來隨著技術進步，CRISPR工具箱的功能愈加豐富，實現了在基因組中插入可精確編輯的基因序列，下一個十年的目標將是在基因組編輯應用中優化并高效利用這些技術。經典的Cas9編輯通過HDR從共遞送供體模板中獲取基因原料，向目標位點中引入轉基因（圖4C）。目前這一方法廣泛運用于基因組工程中的許多領域。最近值得關注的研究是通過這一方法將熒光標記整合進超過1 000種人類蛋白質中，研究它們的定位和交互作用。HDR介導的CRISPR-Cas9編輯在治療方法的臨床前和臨床測試（尤其是α1-抗胰蛋白酶缺乏癥和腫瘤免疫療法）中取得了令人鼓舞的結果。但HDR介導的CRISPR-Cas9也有其局限性，例如它只能用于分裂細胞中，供體模板遞送也存在困難，并且在引入DSB后還存在精確性問題。雖然堿基編輯技術能夠處理特定單核苷酸變異，但許多人類致病性基因變異需要通過插入小的基因序列以修復得失位，因此需要比HDR介導CRISPR-Cas9更精確的方法。

先導編輯是另一種不引入DSB的情況下插入和刪除DNA序列的方法，但其技術方法還需要進一步優化。先導編輯器的組件是nCas9和逆轉錄酶（RT）的融合物，以及先導編輯向導RNA（pegRNA，用于指示nCas9到達目標位點，并用作指導RT進行編輯的模板）。不同于HDR方法，先導編輯能夠在分裂和非分裂細胞中引入基因改造，這對于校正靜止期細胞（如神經元或造血干細胞）的變異而言很有用。當編輯窗內存在多個目標堿基，以及PAM序列不緊鄰目標編輯位點時，先導編輯相比堿基編輯也具有一定優勢。目前先導編輯已經應用于多種細胞類型、類器官、小鼠胚胎和植物，是一種準確而相對精確的編輯工具，但較低的編輯效率限制了其應用。在類器官和小鼠中應用先導編輯的研究中并沒有檢測到脫靶編輯。研究報告的預期外得失位形成很少，先導編輯中正確編輯與得失位形成的比例相對HDR要高約30倍。遺憾的是，很多應用中先導編輯表現出較低的效率。在一項與修復腸道囊性纖維化（CF）類器官變異有關的研究中，先導編輯的效率相對HDR要低30倍。雖然研究者因此開發了許多高效先導編輯方法，但卻形成了更高比例的得失位。目前堿基編輯器在編輯效率和精確性上仍然優于先導編輯。未來十年中先導編輯的目標是在不妥協編輯產物純凈性的條件下提高效率，如此先導編輯可能成為功能最豐富的精確編輯方法。近期研究發現將Cas9和RT在物理上分開并不會影響細胞中的先導編輯水平，提示RT能夠在不與Cas9融合的情況下與編輯位點結合，這是否意味著RT會在其他RNA-DNA雜交位點產生預期外的結合？還需要進一步研究，才能得到結論。優化先導編輯工具需要基因工程設計，以及優化pegRNA等組件。

要實現大型基因插入，CRISPR基因組工程的新興方法是RNA導向的DNA轉座技術。CRISPR相關轉座子（CAST）能夠實現RNA導向下精確整合進多達10kb的大型DNA序列。目前這一技術僅應用于一些原核細胞，暫無應用于哺乳動物細胞的報道。該新興領域還處在早期階段，其工作機制還需要進一步闡明，也少有計算機預測CAST系統得到表征。在CAST應用于基因組工程前還需要進一步的科學研究、測試和基因工程設計。

重組酶功能豐富，能夠實現基因的插入、刪除、倒位和置換，將重組酶與Cas蛋白相結合成了工具開發的新方向，或將進一步豐富CRISPR工具箱的功能。近期，這種新方向帶來了兩種新方法，能夠通過基因編程在人類細胞中整合進大型DNA序列。其中一種方法利用位點特定靶向元件的可編程擴增物（PASTE），通過Cas9、逆轉錄酶和絲氨酸整合酶三者的基因工程融合蛋白實現多重插入大型DNA序列，包含不同內源基因的熒光標記。另一種方法利用雙先導編輯（twinPE），包括一個先導編輯器和兩個先導編輯向導RNA，在與位點特異絲氨酸重組酶結合時能夠實現大型基因的插入和倒位。研究利用這一方法校正人類細胞中和亨特綜合征相關的大型倒位序列，其效率可達約9%。值得注意的是這些研究并沒有報告可檢測的脫靶插入。可編程基因插入的方法需要進一步表征和優化，以增加編輯效率用于潛在的治療方法。可編程基因插入對基因組工程的潛在影響將會繼續推動發現和創新，在尋找新方法的同時優化現有技術。

體內外的編輯器遞送

近來，CRISPR編輯器的技術進展頗多，但編輯器的遞送方法成了有機體中基因組編輯技術的瓶頸，需要創新方法和基因工程設計以提高遞送效率、靶向特異性和安全性。遞送技術的進步在開發基于CRISPR的治療方法中有重要意義。肝臟是很好的例子，向肝臟遞送CRISPR編輯器的效率高，因此CRISPR技術在臨床上可用性較高。但是對于一些難以遞送的器官，CRISPR治療方法的可用性就會被低遞送效率影響，從而需要進一步開發遞送策略。目前用于人類的潛在CRISPR療法在遞送策略上有兩種：體外方法，也即細胞在患者體外進行分離和改造后引入體內；以及體內方法，也即直接遞送CRISPR組件對患者細胞進行編輯。體外方法常用于編輯造血干細胞、祖細胞以及白細胞，在細胞類型上具有較高的特異性，編輯的質量控制也較為嚴格，但編輯的細胞必須能夠在體外培養中存活和擴增（達到重新移植的最低要求），并在體內恢復細胞功能，因此限制了細胞種類。體內方法相對于體外編輯擴展了CRISPR編輯的細胞種類，讓CRISPR可以治療更多種遺傳病。利用體內遞送在人體中獲得一定成功的兩個案例是：一例是治療轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性，這是第一例系統性的體內CRISPR遞送，利用靶向脂質納米微粒（LNP）將CRISPR組件遞送至肝臟；另一例則是治療先天性黑蒙癥10型，通過直接注射腺相關病毒載體將RNA向導酶運送至眼球中。

這些成功案例展現出體內基因組編輯技術的無限潛力，但總體而言，有效體內遞送CRISPR編輯器仍然存在許多生物學困難。對于系統性遞送技術而言，遞送介質需要保護“貨物”在從血管外滲的過程中不被降解，避免調理作用和吞噬作用，繼而高效穿過組織間隙，最終通過內吞作用高效釋放貨物（圖4D）。CRISPR貨物釋放后需要定位細胞核并靶向染色體的目標位點。從第一步血管內注射到最終實際靶向位點的編輯效果的每一步，都有一系列困難需要基因工程設計和創新加以攻克。其中一個問題是如何控制遞送介質的尺寸（通常由貨物的尺寸限制），這對于繞過血管內皮和血管間的組織間隙并靶向細胞是一個挑戰。研究者為此致力設計并開發更小的CRISPR編輯器，以提升遞送效率。另一個問題是防止靶外細胞攝取編輯器并進行編輯，解決方法可以在CRISPR RNP上結合一個靶向分子，如抗體單鏈可變片段或糖蛋白。還可以利用基因工程設計或進化手段使遞送介質靶向特定細胞。一種系統性遞送的策略是對目標組織進行注射，能夠避免對其他組織或器官進行編輯。但直接注射會讓基因組編輯的范圍限定在局部空間的相對少量的細胞中，而且還需要目標器官具備進行這種直接注射的條件。

在各類方法中，“貨物”共有三種形式：質粒DNA（gt;6 400kDa，運送10kb質粒DNA）編碼CRISPR-Cas9和gRNA（二者一同或分開均可）、Cas9 mRNA（1 400kDa）和gRNA（34kDa），或Cas9-gRNA RNP（194kDa）。相較于RNA或蛋白質，DNA貨物較為穩定，但編輯起始速度較慢，且在編輯過程中控制功能RNP濃度的能力較差。在一些案例中DNA貨物能夠延長Cas9的表達，增加了脫靶效應和免疫原性反應的風險。三者中RNP遞送的編輯起始速度最快，脫靶效應最小，但遞送RNP的方法最為有限。

目前用于哺乳動物系統CRISPR基因編輯的遞送手段很多，但每種方法都有需要解決的問題和應用的限制。這些方法主要分為物理遞送、基于病毒的遞送和基于合成材料的遞送。常用的物理遞送手段包括顯微注射和電穿孔，適用于上述三種貨物形式的CRISPR編輯器，可以控制數量且遞送效率高，但這種方法只能用于體外遞送。基于病毒的遞送方法包括腺相關病毒（AAV）、腺病毒（AdV）和慢病毒，能夠遞送質粒DNA形式的CRISPR貨物，通過人為控制病毒千萬年間進化獲得的能力高效地完成遞送。其中AAV作為CRISPR療法在體內臨床使用中最具前景，目前值得關注的是進行中的先天性黑蒙癥10型臨床試驗、一項即將開始的HIV臨床試驗，以及早老癥臨床前工作都取得了進展。然而，AAV的主要局限在于其運載能力較低。相比之下，AdV和慢病毒具有更大的運載能力，也被用于CRISPR-Cas9的遞送系統，但面臨包括免疫原性問題在內的許多其他挑戰。基于病毒的遞送系統的另一個問題是其高昂的成本，以及勞動密集型的生產方式，AAV和AdV尤其顯著，這是實現大規模生產用于治療患者的主要挑戰。基于合成材料的遞送相對于病毒遞送在安全性、可控性和靈活性方面具有優勢。例如，LNP、陽離子聚合物和肽，以及金納米微粒等材料能夠進行量身定制，可運輸三種形式的貨物（DNA、mRNA和RNP），且免疫適應性好。值得注意的是LNP如上文所述是首個人類系統性體內CRISPR遞送中使用的遞送策略，成功治療了轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。總的來說，基于合成材料的遞送方法相較病毒遞送方法效率不高，這限制了其在體內遞送至可及性不佳器官的能力。盡管通過優化能夠進一步提高遞送效果，但最高效率會被合成材料臃腫的體積以及陽離子的特性（影響其進入組織間隙的能力）而限制。近期，細胞外囊泡和病毒樣顆粒（VLP，病毒衣殼和/或結構蛋白的類似物，能夠轉染細胞但不具有病毒的遺傳物質）成為遞送技術中具有前景的方法，它結合了基于病毒和合成材料遞送方法的優點，在具有病毒遞送的高遞送效率的同時，不用擔心其隨機轉基因整合造成安全問題或編輯器表達時間過長。領域中令人激動的技術進步是利用不同的衣殼糖蛋白靶向特定細胞種類，這利用了VLP的細胞趨向性，近期在體內外遞送和編輯中都有成功案例。人類CRISPR療法的未來將很大程度上取決于以下幾點：不斷進步的遞送策略、創新性的遞送方式、發現并設計更加緊湊的CRISPR編輯器。

在哺乳動物系統外，植物中CRISPR試劑的遞送技術也有進步。植物的細胞壁的分子大小排除限（SEL，可經擴散作用通過胞間連絲的最大分子直徑）約5至20納米，這為貨物運送帶來了挑戰。目前的兩種主要方法分別是利用農桿菌遞送質粒DNA（將轉移的DNA整合進植物基因組中），以及基因槍法（物理上將細胞壁打開缺口，引入貨物）。這些方法的主要缺陷在于CRISPR工具盒會隨機插入植物基因組。為了實現無轉基因的育種，研究者設計了一些RNP遞送的新方法，包括利用聚乙二醇介導細胞轉染、基因槍法、電穿孔或脂質轉染。這些方法具有一定前景，隨著遞送效率的提高，以及原生質編輯使植物再生能力提升，RNP在植物中會有更廣泛的應用。

現在和將來的應用

可編程基因組編輯技術的問世為細胞和基因療法治療甚至治愈癌癥奠定了基礎。CRISPR療法的應用不勝枚舉，其中鐮狀細胞病（SCD）的療法稱得上是價值和風險共存的極佳案例。目前FDA批準了至少8個基于CRISPR的SCD療法臨床試驗，且有更多針對血液系統疾病的試驗正在進行中或是即將開始，預計FDA將在2023年正式批準首個療法。然而，廣泛利用CRISPR治愈SCD仍面臨諸多困難。為了將基因組編輯技術作為一種標準療法，需要解決為每一個患者量身定制基因編輯細胞的難題、骨髓移植相關的安排協調問題，以及昂貴的價格問題——每位患者可高達2 000 000美元。但如果一種新的基因組編輯器遞送形式問世，不再需要體外細胞編輯和骨髓移植，CRISPR療法將發生天翻地覆的變化，進入全新的時代，基因療法技術會得到更加廣泛的應用。

CRISPR技術在臨床應用之外，正對農業和畜牧業產生深遠影響。CRISPR編輯食物正準備進入市場，包括CRISPR技術改良的營養豐富的番茄，以及兩種CRISPR編輯的魚類（生長速度快的紅鰭東方鲀和可編輯區域更廣的紅鯛）在日本獲批上市。這些農業應用中，CRISPR實現了小片段基因改變的精確“轉移”，讓目標性狀能夠從一個物種轉移至另一個——其他任何方法都無法實現。除了小片段基因擾動外，CRISPR也具有產生性的基因變異和復雜基因編輯的潛力，這在技術出現前從未在自然界中觀察到。一個關鍵的案例是近期利用多重編輯在小麥中同時敲除和激活不同的基因，引入抗病性的同時恢復生長能力和產量。這些只是各式基因組編輯技術的開始，這項技術在未來將繼續對我們的生活產生影響。

CRISPR-Cas9作為細菌免疫系統的一部分，利用RNA導向機制識別并剪切DNA序列。這一基礎的生物化學過程成了基因組編輯技術的基礎，拓寬了基礎和應用生物學研究的邊界，從發育生物學和植物遺傳學，到鐮狀細胞病的醫療方法和畜牧業。新的基于CRISPR的酶以及和CRISPR相關的酶將不斷出現，幫助我們更好地理解微生物系統的生物學本質，并利用它們在其他細胞和有機體中進行基因組編輯。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a是最為廣泛應用的基因組編輯酶，成為全球科研實驗室的工具。基因組編輯技術賦能的基礎研究證實了CRISPR技術的跨領域本質，也展現其作為可用工具出現的良好時機。其廣泛應用反過來推動CRISPR工具箱進步，用于特定核苷酸的精準編輯，以及整合產生新的遺傳信息。在未來的十年中，基因組編輯研究和應用將會繼續加速，并與機器學習、活細胞成像和更快、更便宜的測序技術結合（圖5）。上一個十年的研究重點在于建立CRISPR平臺，那么這些平臺在下一個十年種將會展現出真實世界中的影響力。在診所中我們將看到更多各式各樣的臨床試驗，為開發下一代基因和細胞療法提供數據基礎。隨著臨床應用的擴展，CRISPR或將成為一種保護健康的工具。舉例來說，當基因編輯在治療疾病中足夠安全和有效之后，或許能夠用于預防神經退行性疾病和心血管疾病。這一方向需要深入理解多基因病的遺傳學本質，并開發靶向腦和心的遞送方法——二者都絕非易事。這些領域的潛在利益將會激勵研究者取得目前無法想象的成果。在農業中，CRISPR篩選將繼續幫助洞見基因工程中動植物的多基因性狀。利用CRISPR開發的產品——無論是用于移植的豬器官、抗干旱的高產稻米，或是利用CRISPR編輯技術進行精細的微生物組調節以保持健康——都將成為常規。CRISPR同時也證實了好奇心驅動的研究、創新和技術進步之間的密切關系。當我們繼續探究自然世界，將會發現更多的不可思議，并利用它們在真實世界中造福人類和我們的星球。

資料來源 Science

成本、管控和可得性

隨著CRISPR技術逐漸展現治療潛力，需要進一步考慮可支付性、監督管理和可得性等重要因素。CRISPR治療方法發展和普及的主要挑戰是成本問題。這種療法的制造成本會包括生產CRISPR編輯器和遞送介質的花費，實現大規模生產面臨諸多困難。舉例來說，基于病毒的遞送系統是開發CRISPR療法中的熱門策略，但生產病毒介質需要昂貴的培養系統和能夠生產足量病毒的設施。因此降低成本的重要方法是繼續優化開發過程，并建立相關設施增加制造病毒載體產量。此外，治療方法過程本身成本也較高，尤其是體外方法在培養基中擴增細胞耗時費力，同時對于自體造血干細胞骨髓移植的患者還需要在治療前接受化療。

生產廠商也要負擔監管成本，進行額外的表征和嚴格的安全與質量控制，這對于研發型或學術型生產廠商而言具有挑戰性。隨著許多基于CRISPR的治療方法逐漸進入后期臨床試驗，生產廠商需要建立設施并負擔成本，以提供符合實際要求的產品。廠商需要自負成本以得到FDA批準，這在逐利的情景中可能會導致廠商放棄開發治療方法，近期就出現在腺苷脫氨酶嚴重聯合免疫缺陷癥（ADA-SCID）的基因療法開發中，盡管其展現出有前景的長期結果。即使一種治療方法通過了所有的臨床試驗階段并得到了FDA的批準，多數患者也承受不起廠商為收回開發成本而設定的零售價格，這需要衛生保健系統進行一定的支持。盡管開發新療法的成本不可避免，但用CRISPR治療技術造福人類的動力，將會激勵創新，開發出高效率、低成本，同時符合監管標準的生產策略。

本文作者喬伊 · 王（Joy Wang）和詹妮弗 · 杜德納（Jennifer Doudna）來自美國加州大學伯克利分校化學系、加州大學伯克利分校創新基因組學研究所。