化肝煎對慢性胃炎和非酒精性脂肪性肝病異病同治作用機制的網絡藥理學研究*

盛丹丹，楊帆，郭宏舉，錢奇芳，劉芳，史寧△

（1.中國人民解放軍戰略支援部隊特色醫學中心，北京 100101；2.中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院，重慶 400038）

慢性胃炎為臨床常見疾病，主要表現為反酸、疼痛、腹脹等癥狀，因多種致病因素對胃黏膜上皮細胞的反復侵襲，導致持續性慢性炎癥改變［1］，如不及時、有效治療，易發展為胃癌［2］。西藥主要通過抑制胃酸分泌、保護胃黏膜、根除幽門螺桿菌（HP）、促進胃腸蠕動等措施進行治療，但有細菌耐藥、病情復發等缺點。慢性胃炎屬中醫“胃脘痛”“痞滿”“吐酸”等范疇，其病位雖在胃，但其發生與肝、脾功能密切相關。疏肝法為慢性胃炎的中醫常用療法，常用方劑包括化肝煎、柴胡疏肝散、石斛養胃湯、半夏瀉心湯等［3-5］，可有效緩解患者不適，降低復發率，顯著提升療效［6］。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）為全球最常見的肝病，屬代謝功能障礙相關性脂肪肝病［7］，目前尚無批準療法［8］。《非酒精性脂肪性肝病中醫診療專家共識意見（2017）》指出，采用疏肝健脾方法治療肝郁脾虛證［9］。化肝煎出自《景岳全書》，由陳皮、青皮、丹皮、梔子、白芍、澤瀉、土貝母組方，具有疏肝瀉熱功效，化肝煎加減用于治療慢性胃炎［10-12］和NAFLD［13-14］的療效顯著，但其異病同治的作用機制尚未闡明。本研究中基于網絡藥理學和分子對接技術，初步探討了化肝煎對慢性胃炎和NAFLD異病同治的作用機制。現報道如下。

1 研究方法

1.1 篩選化肝煎活性成分及靶點

在中藥系統網絡藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中，以“陳皮”“青皮”“白芍”“丹皮”“梔子”“澤瀉”“土貝母”為關鍵詞搜索，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18%的化合物為化肝煎方中的有效活性成分，同時通過檢索文獻對未入選但有相關活性研究的成分進行補充，匯集全部有效活性成分及藥物活性成分相關靶點。利用Uniprot數據庫將靶點名稱轉變成標準基因名稱，得到化肝煎靶點基因。

1.2 建立與慢性胃炎和NAFLD的靶點交集

在OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數據庫中，以“chronic gastritis”“nonalcoholic fatty liver disease”為關鍵詞，搜索2種疾病的作用靶點，合并并刪除重復靶點，得到有效靶點。采用Venny 2.1軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）處理慢性胃炎、NAFLD和化肝煎活性成分的靶點，得交集靶點，并繪制韋恩圖。

1.3 構建藥物-活性成分-靶點網絡

利用獲得的交集靶點基因反向篩查化肝煎中對應的藥物活性成分，借助Cytoscape_v 3.8.0軟件構建藥物-活性成分-靶點網絡。

1.4 構建藥物與疾病蛋白相互作用（PPI）網絡

采用String數據庫（https：//cn.string-db.org/）對1.2項下交集靶點進行PPI分析，物種限定為Homo Sapiens，中置信度（medium confidence）＞0.4。通過Cytoscape_v 3.8.0軟件進行可視化分析，運用CytoHubba插件篩選出PPI網絡的核心靶點。

1.5 富集分析

使用R語言軟件對交集靶點基因進行基因本體論（GO）生物功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并對分析結果繪制氣泡圖進行可視化處理（氣泡大小代表富集基因數目；adjustedPvalue顏色從紅色至紫色，表示值從大到小，富集程度越來越顯著）。

1.6 分子對接

選取PPI網絡中節點度值排名前3的靶蛋白（受體蛋白）和藥物-活性成分-靶點網絡中節點度值排名靠前的藥物活性成分（配體分子）進行分子對接驗證。從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載藥物活性成分的2D結構，從PDB數據庫（https：//www1.rcsb.org）下載受體蛋白的3D結構，利用PyMOL軟件去掉受體蛋白配體，AutoDockTools軟件對受體蛋白及其配體分子進行去水、加氫、加電荷操作，并進行分子對接。利用PyMOL軟件將對接結果進行可視化處理。

2 結果與分析

2.1 活性成分及靶點獲取

共得到藥物化學成分57個［15］，預測靶點243個。

2.2 疾病靶點獲取

分別獲得慢性胃炎和NAFLD疾病靶點2 756個和859個，與化肝煎活性成分的靶點取交集，得到三者的交集靶點36個，見圖1。根據交集靶點反向篩選其對應藥物活性成分，獲得同時治療2種疾病的潛在藥物活性成分，詳見表1。

圖1 化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD交集靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the common targets of Huagan Decoction in the treatment of chronic gastritis and NAFLD

表1 化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD關鍵活性成分基本信息Tab.1 Basic information of key active components of Huagan Decoction in the treatment of chronic gastritis and NAFLD

2.3 藥物-活性成分-靶點網絡

共23個活性成分、66個節點和114條邊，見圖2（A1，A2，A3代表陳皮、青皮共有成分，B1代表丹皮、梔子共有成分，C1代表白芍、丹皮共有成分，D1代表白芍、丹皮、梔子共有成分，E1代表白芍、梔子、土貝母共有成分）。以節點度值設置節點面積大小，并按節點度值大小進行排列篩選。節點度值排前5的活性成分為MOL000098（quercetin/槲皮素）、MOL000422（kaempferol/山柰酚）、MOL005828（nobiletin/川陳皮素）、MOL004328（naringenin/柚皮素）、MOL003095［5-羥基-7-甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）色酮］。

圖2 化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD藥物-活性成分-靶點網絡Fig.2 Drugs-active components-targets network of Huagan Decoction in the treatment of chronic gastritis and NAFLD

2.4 PPI分析

PPI網絡包含36個節點和307條邊，平均度值為17.06，無游離節點，見圖3（網絡中各節點的大小、顏色與其度值成正比，節點面積越大、顏色越深，其度值就越高，在PPI網絡中越關鍵）。PPI網絡中排名前10的核心靶點（圖4），包括白細胞介素1β（IL-1β）、表皮生長因子受體（EGFR）、細胞腫瘤抗原P53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL-6）、白蛋白（ALB）、細胞趨化因子8（CXCL8）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、轉化生長因子β1（TGF-β1）和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。上述靶點在PPI網絡中起關鍵作用，可能是化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD的關鍵靶點。

圖3 化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD交集靶點的PPI網絡Fig.3 PPI network of common targets of Huagan Decoction inthe treatment of chronic gastritis and NAFLD

圖4 核心靶點的PPI網絡Fig.4 PPI network of core targets

2.5 富集分析

GO生物功能富集分析共獲得1 445個生物過程（BP），13個細胞組分（CC），58個分子功能（MF）。基于P值大小，分別篩選BP，CC，MF排名前10的條目進行分析（圖5），可見，化肝煎異病同治靶點參與的生物過程包括傷口愈合過程、平滑肌細胞增殖及調節增殖過程、營養應答過程、細菌源分子應答過程、脂多糖應答過程等，細胞組分主要影響核膜、內質網腔、內吞囊泡、囊泡腔等，分子功能主要涉及細胞因子受體結合、DNA轉錄因子受體結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、受體配體活性、細胞因子活性等。KEGG通路富集分析獲得125條信號通路，其中與化肝煎異病同治相關的有晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路、Janus酪氨酸蛋白激酶-信號轉導及轉錄激活因子（JAK-STAT）信號通路、白細胞介素17（IL-17）等信號通路（圖6）。

圖5 化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD作用靶點GO生物富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of targets of Huagan Decoction in the treatment of chronic gastritis and NAFLD based on the GO bio-concentration analysis

圖6 化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD作用靶點KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of targets of Huagan Decoction in the treatment of chronic gastritis and NAFLD based on the KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接驗證

配體與受體結合能小于0，表示其能自發結合，且結合能越小，表示結合構象越穩定，一般認為，結合能≤-5 kcal/mol時配體與受體有良好的結合性。結果見表2，可知核心靶點與藥物成分均具有較強的相互作用。將表2中對接模式進行可視化分析（圖7）。分子對接結果顯示，化肝煎主要活性成分與靶點蛋白能很好地結合，證實角鯊烯、槲皮素、芍藥苷、山柰酚、4-氧-甲基-芍藥苷治療慢性胃炎和NAFLD的可能性。

圖7 化肝煎活性成分與關鍵靶點的分子對接圖Fig.7 Molecular docking of active components of Huagan Decoction with key targets

表2 化肝煎活性成分與關鍵靶點分子對接結果Tab.2 Molecular docking of active components of Huagan Decoction with key targets

3 討論

慢性胃炎和NAFLD在發生和發展過程中具有關聯性，如HP不僅是慢性胃炎的主要誘因，且是NAFLD發展的獨立危險因素之一［16］。研究發現，在NAFLD患者和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的肝臟樣本中存在HP的DNA/RNA［17-18］，推測HP可能通過十二指腸和膽道由胃進入肝臟［19］，誘導NAFLD發生。化肝煎在2種疾病中均有較好的臨床療效，但其異病同治的作用機制尚未闡明。故本研究中基于網絡藥理學探討了化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD可能的作用機制，為化肝煎異病同治的臨床應用和基礎研究提供了思路。

本研究中對化肝煎方進行網絡藥理學分析和篩選知其有57個活性成分（OB≥30%且DL≥0.18%），其中同時治療慢性胃炎和NAFLD的關鍵成分有23種，藥物-活性成分-靶點網絡節點度值排名前列的活性成分為槲皮素、山柰酚、川陳皮素、柚皮素、5-羥基-7-甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）色酮、β-谷甾醇、角鯊烯、豆甾醇、兒茶素。槲皮素、山柰酚、柚皮素均屬黃酮類化合物。研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗疲勞、抗癌、抗微生物等多種生物學功能，可通過調節DNA修復系統、抑癌基因、緊密連接蛋白保持胃黏膜的完整性［20］，可通過改善肝臟脂質累積、調節腸道微生物群代謝治療NAFLD［21］。在慢性胃炎模型小鼠中，槲皮素可通過p38促分裂原活蛋白激酶（MAPK）通路維持胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡平衡，阻止HP誘導胃炎的發生［22-23］。在高脂飲食誘導的NAFLD模型大鼠中，槲皮素通過抑制MAPK通路改善肝臟脂質沉積、炎癥和纖維化［24］，發揮治療NAFLD作用。山柰酚可通過降低髓過氧物酶活性，下調TNF-α和IL-1β水平，上調一氧化氮水平以維持胃黏膜蛋白的表達，保護胃黏膜免受損傷［25］。在HepG2細胞中，山柰酚可通過抑制脂肪生成蛋白、脂滴蛋白、氧化應激相關蛋白的表達減弱油酸引起的脂質累積和氧化應激，可作為預防和治療NAFLD的候選藥物［26］。柚皮素能調節急性和慢性炎癥，可有效控制多種炎癥相關疾病（如膿毒癥、急性肝病、纖維化和癌癥）［27］。BAO等［28］的體外研究發現，柚皮素可通過抑制AKT通路降低基質金屬蛋白酶9（MMP9）表達誘導胃癌細胞凋亡，尚未發現其在胃炎中的相關研究。臨床試驗結果顯示，NAFLD患者攝入柚皮素后，血清中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平降低，高密度脂蛋白水平升高，表明柚皮素可調節NAFLD患者的血脂［29］。川陳皮素是一種多甲氧基黃酮類化合物，通過減少細胞中活性氧產生、降低脂質過氧化物和谷胱甘肽的含量，抑制HP引起的炎癥感染［30］，長期低劑量補充川陳皮素可調節肝臟膽固醇合成、脂肪合成、脂肪酸氧化，減輕高脂飲食誘導的NAFLD［31］。β-谷甾醇是一種植物甾醇，在各種胃腸疾病中均有治療作用［32］，以及抗高脂血癥和護肝作用，能改善由飲食誘導的NAFLD［33-34］。故化肝煎主要通過槲皮素、山柰酚、柚皮素、川陳皮素等活性成分發揮異病同治作用。

化肝煎與慢性胃炎和NAFLD的交集靶點有36個。PPI網絡圖中節點度值排名靠前的靶點有TNF，IL-6，ALB，IL-1β，EGFR，TP53，CXCL8等。慢性胃炎在組織學中表現為胃黏膜炎性細胞浸潤。在炎癥進展過程中，信號級聯反應被激活，胃黏膜上皮細胞通過分泌一系列細胞因子和趨化因子（如IL-6和IL-1β）募集中性粒細胞和巨噬細胞，造成炎性浸潤。樹突狀細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞也可造成浸潤并分泌TNF-α、IL-12、人單核細胞趨化因子-1（MCP-1）等炎性因子［35］。TNF-α，IL-6，IL-1β均為促炎因子，是炎性反應中的重要免疫介質。TNF-α可促進胃黏膜細胞凋亡，而持續的細胞凋亡可能導致胃潰瘍等廣泛的胃黏膜損傷［36-37］。在IL-1β轉基因模型小鼠中，IL-1β的高表達可導致嚴重的胃部炎癥及癌變［38］；在IL-1β缺失模型小鼠中，HP感染導致的中性粒細胞和巨噬細胞募集被顯著抑制，炎性細胞浸潤減弱［39］。IL-6持續高表達可引起Th17/Treg失衡，進一步導致自身免疫性疾病和慢性炎性疾病的發生和發展［40］。臨床研究發現，HP陽性患者的IL-6水平顯著高于未感染者，且與慢性胃炎分級相關［41］。TP53是腫瘤抑制蛋白，在檢測DNA損傷中起關鍵作用，HP感染可能導致胃上皮細胞DNA錯配修復不足，這可能增加胃黏膜細胞突變積累的風險和慢性胃癌的風險［42］。NAFLD病理譜廣泛，范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝細胞壞死和炎癥，定義為代謝功能障礙相關性脂肪肝病［7］。TNF-α和IL-6可誘導肝臟脂肪生成和胰島素抵抗，破壞胰島素信號傳導。在IL-6缺失模型小鼠中，若長期給藥會加劇高脂飲食誘導的肝臟脂肪變性［43］。在肝細胞中，IL-1β能促進膽固醇和甘油三酯的累積［44］，NAFLD患者血清中IL-1β水平顯著升高［45］；IL-1β還可增加肝臟中IL-17和TNF-α的表達，加劇肝損傷和肝纖維化［46］；而在NAFLD模型小鼠中，IL-1β或IL-1R1缺失能減輕小鼠肝臟炎癥和纖維化［47］。TP53在NAFLD的發病機制中也有重要作用，在HepG2和Huh7細胞系中，抑制TP53表達可減少棕櫚酸酯誘導的脂質累積［48］；在TP53缺失模型小鼠中，高脂飲食導致的肝臟脂質累積減少［49］。化肝煎主要通過靶向調控促炎因子改善胃黏膜的炎癥，并通過調節其余靶基因保護胃黏膜免受其他損傷，從而治療慢性胃炎；通過改善肝臟中脂質累積，減輕肝臟脂肪變性、纖維化、炎癥，從而發揮抗NAFLD作用。

GO生物功能富集分析結果顯示，化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD過程中參與多種生物過程，涉及的細胞組分、分子功能廣泛，說明化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD是多靶點、多通路的過程。KEGG通路富集分析發現化肝煎發揮治療作用排名前3的關鍵通路為AGERAGE信號通路、JAK-STAT信號通路、IL-17信號通路。慢性胃炎患者多伴隨胃動力障礙癥狀，AGE可通過AGE/RAGE/核因子-κB（NF-κB）通路下調平滑肌收縮蛋白和心肌素的表達，誘發胃動力障礙［50］。AGERAGE信號通路也參與NAFLD的進展。AGE引起的炎癥和氧化應激可致NAFLD從簡單的脂肪變性發展為NASH和纖維化［51］，而氧化應激和炎癥也會誘導AGE的產生［52］。AGE與RAGE結合后激活AGE-RAGE信號通路，進一步誘導氧化應激和炎癥［53］。AGE-RAGE信號通路與氧化應激和炎癥形成惡性循環。臨床研究報道，因AGE和RAGE分泌過多，導致血糖水平升高患者的NAFLD更快進展成纖維化［54］。抑制AGE的產生和阻斷AGE與RAGE的相互作用，有望成為治療慢性胃炎和NAFLD的新手段。JAK-STAT通路介導免疫調節過程，在HP感染導致的胃部炎癥和癌變過程中，細菌通過激活STAT1和上調程序性死亡配體1（PD-L1）表達抑制T淋巴細胞亞群CD8+的抗腫瘤免疫反應，促進胃癌進展［55］。豆甾醇、槲皮素可通過抑制JAK-STAT通路發揮抗腫瘤作用［56-57］。JAK-STAT通路在肝病發病機制中有多種關鍵作用［58］，如在非酒精性肝炎模型小鼠中，肝臟中的自然殺傷細胞通過分泌大量的促炎因子如IL-1β，γ干擾素（IFN-γ），IL-12，趨化因子配體4（CCL4），CCL5，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）激活肝臟中JAK-STAT 1/3和NF-κB信號傳導并誘導肝細胞損傷［59］。山柰酚可通過抗氧化和抗凋亡作用保護肝細胞，對多種肝病發揮治療作用［60］。Th17細胞分泌的促炎細胞因子在HP感染導致的胃部炎癥中起主要作用［61］。臨床研究結果顯示，患者血清中IL-17水平與慢性胃炎嚴重程度呈正相關［62］。研究表明，IL-17/IL-21軸、IL-17/IL-23軸參與維持Th17擴增［63-64］。NAFLD的發病機制涉及多種免疫細胞介導的炎性過程及免疫功能失衡［65］，IL-17在這種炎性反應中起核心作用。NAFLD模型大鼠的Th17/Treg失衡，Th17細胞比例明顯增加導致IL-17大量分泌［66］。IL-17可作用于肝細胞、Kupffer細胞、肝星狀細胞，誘導中性粒細胞募集、膠原沉積、促炎因子和趨化因子的產生［67］。IL-17過表達會促使肝細胞攝取脂質，導致肝細胞損傷/死亡和疾病進展［68］。IL-17通過激活Kupffer細胞，分泌大量的IL-6和TNF-α，加劇肝纖維化［69］。芍藥苷可通過調節Th17/Treg平衡，改善結腸炎［70］。槲皮素可通過Tim-3和TLR4-MyD88-NF-κB信號通路維持Th17/Treg平衡，抑制雷公藤內酯素誘導的肝損傷［71］。上述研究結果表明，AGE-RAGE，JAK-STAT，IL-17信號通路與慢性胃炎和NAFLD的發生與發展密切相關，化肝煎活性成分有可能通過作用于多條信號通路發揮異病同治作用。

綜上所述，基于網絡藥理學方法和分子對接技術對化肝煎治療慢性胃炎和NAFLD的活性成分、潛在作用靶點和分子機制進行了初步探討，闡述了化肝煎通過多成分、多靶點、多通路的協同作用，影響炎癥進展、脂質累積、氧化應激而發揮療效。但基于網絡藥理學方法預測活性成分和潛在機制也存在局限性，篩選出的活性成分可能與患者血液中實際吸收的成分不一致，且未能區分活性成分對潛在靶點的抑制作用和激活作用。未來研究中需對潛在有效成分進行進一步的實驗驗證。