大鼠排泄物中ZCY-15排泄特征分析*

陸嘉君，陳冰，林城江

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海 200025）

阿爾茨海默病（AD）是最常見的癡呆疾病，屬進展緩慢的神經退行性疾病［1］，主要病理特征為神經細胞外的β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集和細胞內的tau聚集或神經纖維纏結（NFTs）的形成［2-3］。AD病例［4］最早于1907年報道，但其發病機制仍未明晰。AD患者的認知功能進行性喪失可能由腦功能紊亂或中毒、感染和循環系統異常等因素引起，導致大腦供氧減少、營養缺乏及腫瘤發生等［5-6］。目前，尚無治愈方法，現有方法僅可改善癥狀［7-8］，治療藥物有乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEIs）［9］（包括多奈哌齊［10］、加蘭他明［11］和利凡他明［12］）和應用于中重度AD的美金剛［13］。沈陽藥科大學藥化教研室參照美金剛及其酰胺類似物的結構設計并合成了系列芳香類美金剛類似物，同時，以AD模型大鼠為研究對象，通過Morris水迷宮試驗、Y迷宮試驗和新物體辨別等試驗驗證了ZCY-15［N-（3，5-二甲基金剛烷-1-基）-N-（3-甲基苯基）脲］具有顯著的抗AD作用，改善學習和記憶能力的效果略優于美金剛，有成藥潛力［14］。目前國內外未見ZCY-15在大鼠體內的排泄研究。本研究中建立了測定大鼠排泄物中ZCY-15濃度的超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法，并分析了ZCY-15在大鼠體內的排泄特征。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

I-CLASS型超高效液相色譜系統，Xevo TQ-S型三重四極桿質譜儀（美國Waters公司）；5810R型全自動高速冷凍離心機，Mix-Mate型渦旋混勻器（德國Eppendorf公司）；KS-250N型恒溫超聲儀（上海柯祁儀器設備有限公司）；XP105DR型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）；MD200-2型氮氣吹干儀（上海那艾儀器有限公司）；HX2001T型體重秤（慈溪市天東衡器廠）。

1.2 試藥

ZCY-15（由沈陽藥科大學藥物化學教研室提供，含量≥98.0%）；卡利拉嗪［內標（IS），中國食品藥品檢定研究院，含量≥99.9%］；醋酸銨（天津市大茂化學試劑廠，含量≥99.9%）；甲醇、乙酸乙酯均為色譜純；乙腈、甲酸均為質譜純；水為純凈水。

1.3 動物

SD大鼠60只，雌雄各半，7～9周，體質量（220±30）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2018-0006，實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2019-0027。將同性別SD大鼠每籠4只地安置于空調恒溫室進行適應性飼養，室溫20～24℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h，自由進食與飲水。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為AcquityUPLCBEHC18柱（100mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min時70%A，1.0～2.5 min時95%A，2.6～4.0 min時70%A）；流速為0.25 mL/min；柱溫為50℃；進樣量為5μL。

2.1.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為150℃；霧化氣溫度為350℃；毛細管離子源電壓為3 000 V；檢測方式為正離子檢測；掃描方式為多反應監測（MRM）模式；定量分析的離子反應m/z分別為ZCY-15 313.2→163.1，IS：427.2→382.0。

2.2 排泄樣品預處理

分別精密量取大鼠空白膽汁、尿液樣品各50μL，稱量空白糞便樣品50 mg，精密稱定，分別加水200μL，渦旋振蕩5 min，加乙酸乙酯300μL，混勻，渦旋振蕩5 min，13 000 r/min離 心5 min，精密 量 取上清 液260μL，用氮氣吹干，加70%甲醇100μL復溶，渦旋振蕩5 min，13 000 r/min離心5 min，精密量取上清液20μL，置EP管中，加流動相180μL，渦旋15 s，轉移至進樣瓶。

2.3 溶液制備

取ZCY-15適量，精密稱定，配制成質量濃度為1μg/mL的ZCY-15貯備液，用乙腈逐級稀釋制成質量濃度分別為1，5，10，25，50，100，200 ng/mL的系列標準溶液和質量濃度分別為2，20，160 ng/mL的質量控制溶液。4℃保存待用。

取IS適量，精密稱定，配制成質量濃度為10μg/mL的內標貯備液，用甲醇稀釋并定容，反復搖勻，得質量濃度為50 ng/mL的IS工作液。4℃保存待用。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：ZCY-15為外源性物質，故采用大鼠的空白膽汁、尿液及糞便作為標準曲線基質。取大鼠空白膽汁、尿液、糞便適量；以及分別加入5μL ZCY-15和IS工作液的50μL大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿，按2.3項下方法操作，按2.1項下試驗條件進樣分析，記錄質譜圖。結果ZCY-15的保留時間為2.24 min，內標為0.95 min。大鼠的膽汁、尿液及糞便中的內源性成分不會干擾ZCY-15和內標的測定。詳見圖1。

圖1 大鼠空白排泄物中ZCY-15和IS超高效液相色譜串聯質譜圖1.Cariprazine 2.ZCY-15A.Blank sample B.Blank sample+IS C.Blank sample+ZCY-15a.Blank bile b.Blank urine c.Blank fecesFig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of ZCY-15 and IS in the blank excreta of rats

線性關系考察：精密量取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿50μL，分別加入ZCY-15系列標準溶液5μL，制成質量濃度分別為1，5，10，25，50，100，200 ng/mL的模擬梯度膽汁、尿液、糞便勻漿樣品，按2.3項下方法操作，按2.1項下試驗條件進樣分析，以ZCY-15質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，每個質量濃度平行3次，結果見表1。ZCY-15質量濃度在1～200 ng/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

表1 大鼠排泄物中ZCY-15的標準曲線（n=7）Tab.1 Standard curves of ZCY-15 in the excreta of rats（n=7）

準確度（RE）和精密度試驗：取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿樣品，按2.3項下方法操作，設定定量下限（LLQ）為1.00 ng/mL，低、中、高3種質量濃度（2，20，160 ng/mL），ZCY-15每個質量濃度平行6份，與“線性關系考察項”樣本連續3 d同時進行測定。根據當日回歸方程計算對應的質量濃度，與實際制備的樣品質量濃度進行比較，計算得ZCY-15的LLQ和低、中、高質量濃度的準確度和精密度，詳見表2。結果準確度和精密度均符合生物樣品測定的規定要求。

表2 大鼠排泄物中ZCY-15精密度試驗結果Tab.2 Results of the precision test of ZCY-15 in the excreta of rats

提取回收率：取大鼠空白膽汁、尿液、糞便樣品，分別加入2.2項下ZCY-15低、高質量濃度（2 ng/mL，160 ng/mL；下同）質控溶液和IS工作液各5μL，按2.3項下方法操作，每個質量濃度平行6份，按擬訂試驗條件進樣分析，記錄對應的色譜峰面積。同時，精密量取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿50μL，分別加入低、高質量濃度ZCY-15質控溶液和IS工作液各5μL，經處理，每個濃度平行6份，按擬訂試驗條件進樣分析，記錄對應的色譜峰面積，計算ZCY-15的提取回收率，結果見表3。可見，提取回收率符合生物樣品測定的規定要求。

表3 大鼠排泄物中ZCY-15的提取回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the extraction recovery test of ZCY-15 in the excreta of rats（n=6）

基質效應：精密量取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿50μL，分別加入2.2項下低、高質量濃度ZCY-15質控溶液和IS工作液各5μL，渦旋10 s，按2.3項下方法操作，每個質量濃度平行6份進樣分析，得色譜峰面積。用水代替勻漿，按2.3項下方法操作，每個質量濃度平行6份，按擬訂試驗條件進樣分析，以基質存在下的色譜峰面積（由空白基質提取后加入ZCY-15和IS）與不含基質的色譜峰面積（ZCY-15和IS的純溶液）比值，計算ZCY-15和IS的基質因子，進一步以ZCY-15基質因子與IS基質因子的比值，計算得內標歸一化基質因子。ZCY-15和IS的基質效應見表4。結果表明，基質效應對排泄物勻漿樣品的測定無明顯影響，符合生物樣品測定的規定要求。

表4 大鼠排泄物中ZCY-15的基質效應（n=6）Tab.4 Matrix effects of ZCY-15 in the excreta of rats（n=6）

穩定性試驗：取大鼠空白膽汁、尿液和糞便勻漿樣品，分別加入2.2項下低、高質量濃度ZCY-15質控溶液和IS工作液各5μL，按2.3項下方法操作，每個質量濃度平行3份，按擬訂試驗條件進樣分析，考察樣品在室溫下放置12 h、3次循環凍融、樣品處理后在液相色譜儀自動進樣器內放置24 h、-20℃凍存30 d的穩定性。結果含ZCY-15的排泄物勻漿樣品具有良好的穩定性，符合生物樣品測定的規定要求。結果見表5至表7。

表5 大鼠膽汁勻漿樣品中ZCY-15的穩定性試驗結果（n=3）Tab.5 Results of the stability test of ZCY-15 in bile homogenate samples of rats（n=3）

表7 大鼠糞便勻漿樣品中ZCY-15的穩定性試驗結果（n=3）Tab.7 Results of the stability test of ZCY-15 in feces homogenate samples of rats（n=3）

稀釋效應：取配制好的質量濃度為1 000 ng/mL ZCY-15的排泄物勻漿樣品10μL，再加入90μL空白排泄物勻漿稀釋，渦旋30 s，按2.3項下方法操作，每個質量濃度平行6份，按擬訂試驗條件進樣分析，并與定量為100 ng/mL的實測值進行比較，得出稀釋效應。當稀釋倍數為10倍時，稀釋的ZCY-15溶液的精密度的RSD為3.95%～6.48%，準確度為5.24%～10.86%。故超出定量上限的ZCY-15樣品可用空白排泄物勻漿稀釋后制樣檢測。

表6 大鼠尿液勻漿樣品中ZCY-15的穩定性試驗結果（n=3）Tab.6 Results of the stability test of ZCY-15 in urine homogenate samples of rats（n=3）

2.5 ZCY-15在大鼠膽汁、尿液和糞便中的排泄特征

分組與排泄樣品采集：稱量ZCY-154.50 mg，精密稱定，置10 mL離心管中，加入100μL二甲基亞砜完全溶解，依次加入160μL吐溫-80、1.4 mL丙二醇、1.6 mL聚氧乙烯蓖麻油-EL，37℃恒溫超聲（功率2 000 W，頻率30kHz，下同）混勻5min，使化合物完全溶解，并轉移至20 mL帶塞玻璃試管中；精密加入16.74 mL生理鹽水，37℃恒溫超聲處理5 min混勻，制成質量濃度為0.225 mg/mL的ZCY-15溶液。給藥前，大鼠禁食12 h，可自由飲水。隨機選取18只SD大鼠（雌雄各半），稱定體質量、標記并計算給藥量。隨機分為膽汁組、尿液組和糞便組，各6只，雌雄各半。膽汁組大鼠以10%水合氯醛麻醉后迅速完成膽管插管，在大鼠清醒后緩慢灌胃ZCY-15（2.25 mg/kg），并于給藥后0～2 h、2～4 h、4～6 h、6～8 h、8～12 h、12～24 h收集膽汁樣本；尿液組和糞便組分別于灌胃ZCY-15后0～2 h、2～4 h、4～6 h、6～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h、48～72 h，收集尿液及糞便樣本。收集的樣本密封處理，-20℃凍存待用。

實際排泄勻漿樣本測定及數據處理：采集大鼠膽汁、尿液和糞便樣本，按2.3項下方法操作，按2.1項下試驗條件檢測，計算ZCY-15的濃度，繪制藥物累計排泄量-時間曲線。

灌胃給藥后，分別采集不同時間點大鼠的膽汁、尿液和糞便，測定ZCY-15濃度并計算各時間段內不同排泄樣本的平均藥物累積排泄量。結果所有采集的尿液樣本中ZCY-15的濃度均低于LLQ，未能檢出；膽汁、糞便樣本中ZCY-15的平均藥物積累排泄量及占比見表8和表9；膽汁和糞便勻漿中ZCY-15的排泄率分別為（0.000 2±0.000 09）%和（0.99±0.57）%。膽汁、糞便勻漿中ZCY-15的平均藥物累積排泄量-時間曲線見圖2。

圖2 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠膽汁、糞便中藥物累積排泄量-時間曲線A.Bile B.FecesFig.2 Cumulative excretion-time curves in bile and feces of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）by gavage

表8 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠膽汁中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.8 Average cumulative excretions and proportions in bile of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

表8 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠膽汁中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.8 Average cumulative excretions and proportions in bile of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

注：-為ZCY-15濃度低于LLQ。表9同。Note：-indicates that the mass concentration of ZCY-15 is lower than the lower limit of quantification（for Tab.8-9）.

時間0～2 h 2～4 h 4～6 h 6～8 h 8～12 h 12～24 h 24～36 h 36～48 h 48～72 h膽汁排泄量（ng）9.58±5.16 3.92±1.67 2.52±1.15 0.87±0.12--膽汁排泄量占比（%）64.88±13.66 26.91±5.26 14.72±4.43 5.09±0.01--

表9 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠糞便中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.9 Average cumulative excretions and proportions in feces of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

表9 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠糞便中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.9 Average cumulative excretions and proportions in feces of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

時間0～2 h 2～4 h 4～6 h 6～8 h 8～12 h 12～24 h 24～36 h 36～48 h 48～72 h糞便排泄量（ng）-1 000±998.9-2 296±1 892 2 011±727.9 111.1±82.81 35.51±37.11 22.85±28.43 43.35±11.66糞便排泄量占比（%）-12.00±11.98-52.89±28.68 47.86±35.44 2.10±0.92 0.72±0.64 0.44±0.43 0.73±0.08

3 討論

大鼠灌胃給藥ZCY-15后，經膽汁排泄的量極少，且呈現時間依賴性，即膽汁勻漿中ZCY-15質量濃度逐漸減少并在給藥后約12 h基本排泄結束，排泄率僅為（0.000 2±0.000 09）%。由此推測，ZCY-15原形藥物幾乎不經膽汁代謝。收集大鼠口服ZCY-15后不同時間段的尿液樣本，均未能檢出ZCY-15，表明ZCY-15不能以原形經尿液排泄。根據以往ZCY-15藥物代謝動力學研究結果可知，大鼠灌胃給藥ZCY-15吸收量較低，生物利用度不高，故推測ZCY-15經糞便排泄量較大。給藥后0～8 h，糞便中ZCY-15的排泄量逐漸升高，給藥后6～8 h達排泄高峰；給藥后8～24 h，排泄量逐步下降，給藥后24 h排泄基本結束。但是經計算得ZCY-15經糞便排泄率僅為（0.99±0.57）%。可見，ZCY-15通過膽汁、尿液和糞便的整體排泄率較低，主要排泄時間為給藥后0～24 h。

綜上所述，本研究中建立的UPLC-MS/MS法能在4 min內準確測定大鼠膽汁、尿液和糞便中ZCY-15的質量濃度，僅少量ZCY-15以原形藥物經糞便排泄，其余主要以代謝產物的形式排出體外。