白及多糖聯合5-氟尿嘧啶對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響

溫艷，張強，曹涵博△

（1.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065；2.陜西省藥品疫苗檢查中心，陜西 西安 710065）

肝癌是我國較常見及高發腫瘤［1］?；瘜W合成藥物對其療效良好，但不良反應較明顯；傳統中藥因其療效較好和不良反應較少的優點在治療癌癥方面具有一定優勢［2］。白及為我國傳統中藥，是蘭科植物白及的干燥塊莖，藥用歷史悠久、價值高，有止血、收斂、生肌、消腫等功效，主要化學成分包括聯芐類、菲類、二氫菲類、萜類化合物等［3］。白及多糖（BSP）為從中藥白及中提取獲得的甘葡聚糖，藥理學研究結果表明具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用，在醫藥領域具有較高價值［4-5］。5-氟尿嘧啶（5-FU）是目前常用于胃癌、食管癌、腸癌等癌癥的治療［6］。細胞凋亡受多基因的嚴格控制，如B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）家族，半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）家族、原癌基因C-myc等［7］。有研究報道多糖對化學藥物治療（簡稱化療）藥物有增效作用［8］。本研究中選取合適質量濃度的BSP，聯合5-FU作用于體外培養的肝癌細胞株，并對其進行活力檢測，分析作用后凋亡相關蛋白基因及蛋白表達的變化，為BSP抗肝癌的作用機制提供實驗證據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥及細胞

儀器：DNM-9606型酶聯免疫檢測儀（德國Thermo公司）；MA-6000型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Tanon 5200型化學發光儀（賽默飛世爾科技公司）；Attune Nxt型流式細胞儀（美國BD公司）；SHB-1600A2型生物安全柜（蘇州凈化設備儀器廠）。

試藥：DMEM基礎培養基、胎牛血清（美國Hyclone公司，批號分別為AG29719232，AF29548181）；青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司，批號為171334）；BSP（陜西師范大學生命科學學院實驗室，以生理鹽水溶解）；5-FU（美國MCE公司，批號為HY-90006）；CCK-8試劑（美國Sigma公司，批號為91963）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為CA1050）；Caspase-8、B淋巴Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白（BAX）、GAPDH、山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（英 國Abcam公司，批號分別為ab32397，ab32124，ab32503，ab8245，b205718，ab205719）。

細胞：人肝癌HepG2細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 方法

細胞活力：采用CCK-8法。取對數生長期的HepG2細胞，接種于96孔板，在37℃、5%CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，加入不同質量濃度（50，100，200，400，800μg/mL）的BSP，另設空白對照（等體積生理鹽水）。每孔加入培養基100μL，每組設5個復孔，分別培養24，48，72 h后加入CCK-8試劑10μL，37℃反應30 min，以酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值。另設對照組（等體積生理鹽水）、BSP組（400μg/mL）、5-FU組（0.02 mol/L）、BSP+5-FU組（400μg/mL+0.02 mol/L），培養細胞48 h，同法操作。

細胞凋亡：采用流式細胞術。取對數生長期的HepG2細胞，接種于24孔板，在37℃、5%CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，同“細胞活力”項分組，分別進行相應處理48 h，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒嚴格按說明書進行染色，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

Caspase-8，BAX，Bcl-2 mRNA表達：采用熒光定量聚合酶鏈式反應。將HepG2細胞接種于6孔板處理48 h，加入Trizol裂解液，再加入氯仿200μL，4℃下12 000g離心15 min，加入等體積異丙醇，4℃下12 000g離心10 min，按Takara反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄和PCR擴增。PCR擴增條件：94℃，5 min；94℃40 s，56℃50 s，72℃10 min，45個循環；72℃10 min。在引物由上海金唯智公司合成，定量PCR結果通過2-ΔΔCt計算，以GAPDH為內參，各組設3個復孔。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

Caspase-8，BAX，Bcl-2蛋白表達：采用Western blot法。將細胞接種于100 mm細胞培養皿中，按“細胞凋亡”項下分組分別處理48 h，加入細胞裂解液，測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，洗脫，二抗室溫孵育1 h，洗脫。用增強型化學發光試劑（ECL）顯影，成像，目的條帶與內參（GAPDH）條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達量。

1.3 數據處理

采用GraphPad 6軟件進行數據分析。數據均以X±s表示，行獨立樣本或配對樣本t檢驗，以及單因素方差分析。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同質量濃度BSP對細胞活力的影響

結果見圖1。處理細胞24 h后，質量濃度為800μg/mL的BSP對細胞活力有顯著抑制作用（P＜0.05）；處理細胞48 h后，質量濃度為400μg/mL和800μg/mL的BSP對細胞活力有顯著抑制作用（P＜0.01），400μg/mL時的抑制率約為20%；處理細胞72 h后，質量濃度分別為100，200，400，800μg/mL的BSP對細胞活力均有顯著抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。綜合考慮，選擇BSP質量濃度為400μg/mL，細胞處理時間為48 h。

圖1 BSP對HepG2細胞活力的影響Note：Compared with 0μg/mL，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.1 Effect of BSP on the viability of HepG2 cells

2.2 BSP+5-FU對細胞活力的影響

400μg/mL BSP和0.02 mol/L 5-FU對HepG2細胞活力的抑制率分別為23%及45%，聯用后達56%，與兩者單獨作用比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 不同藥物對HepG2細胞活力的影響Note：Compared with those in the control group，△P＜0.01；Compared with those in the 5-FU group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with those in the BSP group，aP＜0.05，aaP＜0.01（for Fig.2-5）.Fig.2 Effects of different drugs on the viability of HepG2 cells

2.3 細胞凋亡結果

BSP+5-FU組的細胞凋亡率為（47.46±5.15）%，顯著高于BSP組的（17.10±1.45）%（P＜0.01）及5-FU組的（31.03±2.5）%（P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 不同藥物對細胞凋亡的影響A1.Control group A2.5-FU group A3.BSP+5-FU group A4.BSP groupA.Flow cytometry B.Data statisticsFig.3 Effects of different drugs on the apoptosis of HepG2 cells

2.4 Caspase-8，BAX，Bcl-2 mRNA表達結果

與對照組比較，BSP+5-FU組Caspase-8，BAX mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01），Bal-2 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。與5-FU組和BSP組比較，BSP+5-FU組Caspase-8、BAX mRNA的表達水平顯著升高（P＜0.01）；Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 BAX，Bcl-2，Caspase-8 mRNA表達水平A.BAX B.Bcl-2 C.Caspase-8Fig.4 Expression levels of BAX，BCl-2，Caspase-8 mRNA

2.5 Caspase-8，BAX，Bcl-2蛋白表達結果

與對照組比較，BSP+5-FU組Caspase-8、BAX蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。與5-FU組和BSP組比較，BSP+5-FU組Caspase-8，BAX蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；Bcl-2蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05）。詳見圖5。

圖5 Bcl-2，Caspase-8，BAX蛋白表達水平B1.Caspase-8 B2.Bcl-2 B3.BAXA.Electrophoretogram B.Data statisticsFig.5 Expression levels of Bcl-2，Caspase-8，BAX protein

3 討論

中醫藥可在緩解肝癌患者的臨床癥狀、提高其生活質量和免疫功能、預防復發轉移、延緩腫瘤進展、延長生存時間等方面發揮顯著作用，其作用機制主要體現在誘導細胞凋亡、自噬、阻滯細胞周期、調節免疫功能、抑制轉移和血管生成、逆轉耐藥、增強化學藥物治療（簡稱化療）效果等方面［9-11］。20世紀70年代多糖就被發現參與調控細胞生命活動，并具有重要的生理活性［12］。白及可用于治療消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、跌打損傷和燒傷。大量研究表明，BSP具有較強的抗腫瘤活性［13］，可增強血管內皮細胞的增殖和血管內皮生長因子的表達［14］。

本研究結果顯示，BSP、5-FU單獨作用時均可對HepG2細胞的活力產生抑制作用，兩者聯用產生的抑制作用較單用更明顯，細胞出現明顯的凋亡，Caspase-8、BAX mRNA表達水平顯著升高，其蛋白表達水平亦顯著升高，Bcl-2 mRNA水平和蛋白表達水平明顯降低，這可能是BSP+5-FU對肝癌細胞促凋亡作用的重要機制之一，仍待進一步研究。GAO等［15］的研究表明，多糖與腫瘤細胞膜具有良好的生物相容性，可能有增加藥物進入細胞的能力，這可能是BSP能大幅增加5-FU活性的原因之一。

綜上所述，在體外條件下，BSP+5-FU可明顯抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡，其主要機制可能是通過對凋亡相關蛋白Caspase-8，Bcl-2，BAX等基因的調控發揮作用，BSP可能通過Caspase途徑促進HepG2細胞的凋亡來發揮抗腫瘤作用，但仍需進一步研究。