健脾固腎化瘀湯對糖尿病腎臟病大鼠腎臟保護及IGF-1 mRNA、MCp-1 mRNA和Nephrin mRNA表達的影響*

河北中醫學院附屬滄州中西醫結合醫院內分泌糖尿病科

陳曉婷 潘保朝△ 張 輝△ 蘇秀海 孫文娟 呂樹泉(滄州 061001)

提要 目的：研究健脾固腎化瘀湯對糖尿病腎臟病(DKD)大鼠腎臟病理變化的改善及腎病蛋白(Nephrin)、單核細胞趨化因子1(MCp-1)和類胰島素1號生長因子(IGF-1)的影響。方法：采用雄性Sprague-Dawley大鼠腹腔注射鏈脲霉素(STZ)來復制糖尿病腎病大鼠模型。根據隨機數表隨機選擇6組，即正常組、模型組、雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組(1.9、3.8、7.6 g/kg)，各10只。用藥8周后，測定各組血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇和24 h尿白蛋白的指標。在光學顯微鏡下觀察腎臟的形態學變化。用免疫組化法觀察Nephrin、MCp-1和IGF-1的表達，用RT-PCR方法觀察Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA的表達。結果：與正常組相比，模型組的甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、MCp-1和IGF-1 mRNA的水平明顯升高(P<0.05)，Nephrin mRNA的表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，健脾固腎化瘀湯各組的甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、MCp-1、IGF-1 mRNA水平下降(P<0.05)，Nephrin mRNA水平明顯提高(P<0.05)，且大鼠腎臟組織細胞排列整齊。結論：健脾固腎化瘀湯可下調IGF-1和MCp-1 mRNA的表達，上調Nephrin mRNA的表達，改善腎組織的病理變化，起到保護作用。

由于人口的老齡化程度逐漸加深，全球2型糖尿病的患病率在過去30年中迅速增加，這表明其微血管并發癥糖尿病腎臟病(DKD)的發病率也在迅速提高[1]。DKD為終末期腎病的主要病因，但DKD的發病機制尚不明確，目前尚無特異性治療方法。西醫治療DKD的主要手段是通過藥物控制血壓、血脂和葡萄糖水平[2]，一些新的藥物如胰高糖素樣肽-1受體激動劑、鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑等能在一定程度上減少蛋白尿、改善腎功能進而延緩DKD的進展，但是也會產生胃腸道不適、低血糖、胰腺炎等副作用[3-4]。中醫藥因其多靶點、多組分、多環節、低毒副作用的優勢，已經成為改善DKD患者腎功能，阻止疾病進展的重要治療手段。

健脾固腎化瘀湯是河北省滄州中西醫結合醫院依據中醫經典理論結合多年臨床經驗同時吸收名家經典方劑形成，前期研究表明對DKD患者有良好的臨床效果[5]，但具體作用機制有待考證。本研究首先通過高脂飼料聯合鏈脲霉素(STZ)注射，建立DKD大鼠模型，明確健脾固腎化瘀湯對DKD大鼠的治療作用，其次通過RT-PCR、免疫組化等方法檢測健脾固腎化瘀湯干預后DKD大鼠腎臟組織中腎病蛋白(Nephrin)、單核細胞趨化因子1(MCp-1)、類胰島素1號生長因子(IGF-1)的表達情況，探究健脾固腎化瘀湯治療DKD的內在機制。

1 材料

1.1 動物 60只雄性SPF級SD大鼠，體質量210～230 g，由中國醫學科學院放射醫學研究所提供[動物證書編號：11401300065459，單位許可證編號：SYXK(津)2014-0002]。標準正常飲食。所有動物都被安置在一個溫度和濕度可控的環境中[12 h光/暗循環，(21±2)℃，相對濕度(45±10)%]，并允許自由采食和飲水。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(Cat # 15596-026)；TIANScript RT KIT(Cat # KR104-02)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(Cat # FP205)。

1.3 儀器 QL-902渦旋搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；5415D離心機(Eppendorf)；生物光度計(Eppendorf)；ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.4 藥品 健脾固腎化瘀湯由黃芪60 g，黨參10 g，黃精15 g，白術12 g，茯苓、山藥、芡實、金櫻子各15 g，山茱萸12 g，熟地黃15 g，當歸12 g，川芎30 g，僵蠶、蟬蛻各10 g，水蛭6 g，酒大黃、淫羊藿各10 g組成。中藥是由北京康仁堂藥業有限公司生產的中藥顆粒，按比例加入純凈水制成懸浮液備用。雷米普利片(H200030724)，研末按比例加入純凈水制成懸浮液備用。

2 方法

2.1 分組與建模 大鼠適應性喂養1周，根據隨機數表隨機分為6組，即正常組、模型組、雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組(簡稱低、中、高劑量組)，每組10只。正常組予常規飼料，其余50只給予高糖高脂飼料(10%豬油、20% 蔗糖、2.5% 膽固醇、67.5% 常規飼料)。特殊飼料喂養7周后于第7周末進行腹腔注射STZ 30 mg/kg[以0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)配制成1%的STZ溶液]，注射前12 h禁食不禁水。72 h后尾靜脈采血檢測隨機血糖≥16.7 mmol/L，即可認為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病大鼠繼續喂養1周，1周后開始用代謝籠收集大鼠24 h尿，檢測24 h尿蛋白定量。以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿白蛋白≥30 mg/24 h，作為DKD動物模型建立標準[6]。

2.2 藥物干預 在造模成功后12 h開始服藥。健脾固腎化瘀湯組用健脾固腎化瘀湯煎劑給藥，1次/d，2 mL/次，劑量按等效人體劑量計算。此外，雷米普利組作為陽性對照[7]。健脾固腎化瘀湯分低、中、高劑量組使用，分別為1.9、3.8、7.6 g/kg, 健脾固腎化瘀湯中劑量組3.8 g/kg相當于健脾固腎化瘀湯在人類成人中的日用量，其計算公式如下：等效劑量(g/kg)=人類粗制藥材的臨床用量(g/kg)×6.25。雷米普利組灌胃2 mL/次，1次/d(雷米普利粉末在正常生理鹽水中稀釋至0.001 g/kg[8])。正常組和模型組分別用相同劑量的正常生理鹽水胃內注射，每天1次。各組干預持續8周。在此期間，大鼠自由飲水，標準飲食，環境溫度為(20±2)℃。沒有使用胰島素和其他降糖藥物。

2.3 樣本采集 治療8周后，所有大鼠存活，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，用毛細玻璃管從內眥處采血。將采集的血液置于離心機中，以3 000 r/min的速度高速離心15 min，取上清液儲存于-80 ℃以備后用。在麻醉狀態下，通過頸椎脫位將大鼠處死，并立即從腹部取出雙側腎臟。部分腎臟組織被置于4%多聚甲醛溶液中進行固定。其余的腎臟組織在-80 ℃下保存，以備將來使用。

2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 取腎臟組織進行常規石蠟包埋和切片。石蠟切片厚度為4 μm，然后進行HE染色，顯色后在顯微鏡下觀察組織的病理變化。

2.5 生物化學檢測 使用全自動生化分析儀對血清尿素氮、肌酐、甘油三脂、總膽固醇和24 h尿白蛋白定量水平進行檢測。

2.6 RT-PCR法檢測腎皮質Nephrin、MCp-1和IGF-1mRNA的表達 RT-PCR對IGF-1 mRNA、Nephrin mRNA和MCp-1 mRNA表達進行檢測，嚴格按照定量PCR儀的操作說明書進行。每組10只大鼠進行基因表達分析。腎臟中RNA的分離方法如下。(1)將組織樣本用研缽磨碎，放入離心管中，加入1 mL Trizol 5～10 min；(2)加入0.2 mL氯仿，上下劇烈攪拌15～30 s，然后靜置3 min(冰浴或室溫)；(3)4 ℃，12 000 r/min離心15 min；(4)取水相放入新的EP管，加入0.5 mL異丙醇，混勻，冰浴10 min；(5)4 ℃下12 000 r/min離心10 min；(6)倒出上層液體，沉淀物(1 mL)用75%冰乙醇，混勻；(7)4 ℃，12 000 r/min離心5 min；(8)干燥。加入DEPC處理水以溶解RNA，測量濃度，并在-80 ℃下保存。然后取5 μL RNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢查RNA的完整性。

依次加入2.5 μL稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2 溶液，0.5 μL上游引物和下游引物，最后加水配成總體積25 μL的反應體系。反應體系用DPEC水稀釋至50 μL，并保存在-20 ℃。最后，用熒光定量PCR儀進行2-△△Ct法進行數據的相對定量分析，計算各樣品靶基因的相對定量結果，即其他樣品靶基因mRNA轉錄水平相對于對照樣品的差異。

2.7 通過免疫組化染色檢測腎臟中Nephrin、MCp-1和IGF-1的蛋白質表達情況 通過免疫組化染色評估腎臟中Nephrin、MCp-1和IGF-1的表達[9]。石蠟常規切片2～3 μm,脫蠟至水；PBS沖洗5 min×3次;檸檬酸鹽緩沖液中行抗原熱修復1 min 30 s,冷卻至常溫；PBS沖洗5 min×3次；分別滴加50～100 μL一抗兔抗大鼠Nephrin、MCp-1、IGF-1多抗,4 ℃過夜,同時用PBS代替一抗作陰性對照；次日用PBS洗3次,每次5～10 min;滴加50～100 μL山羊抗兔IgG-FITC,37 ℃,孵育40 min,避光；PBS(振搖)洗滌3次,每次10 min,避光；擦干,封片,4 ℃避光保存待測;全自動多功能熒光顯微鏡觀察,光學顯微鏡下觀察到腎組織棕黃色顆粒沉積為陽性，用Image pro plus對數據進行分析。Nephrin、MCp-1和IGF-1在腎小球中表達。對Nephrin、MCp-1和IGF-1的蛋白質相對水平進行量化并與對照組進行比較。記錄了20個隨機選擇的512×512像素、分辨率為0.4348 μm的彩色視頻圖像。根據RGB顏色參數觀察綜合光密度。

3 結果

3.1 各組大鼠干預后的肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇和24 h尿白蛋白定量水平 干預8周后，與正常組相比，模型組大鼠的肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇、24 h尿白蛋白水平明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組相比，雷米普利組、健脾固腎化瘀煎劑低、中、高劑量組的甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素氮和24 h尿白蛋白均明顯降低(P<0.05)；與雷米普利組相比，健脾固腎化瘀各組的肌酐、尿素氮、24 h尿白蛋白均明顯降低(P<0.05)，其中以中、高劑量組更為明顯，甘油三酯、總膽固醇降低但差異無顯著性(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠干預8周后的尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇和24 h尿白蛋白定量水平的變化

3.2 Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA在各組大鼠干預后的表達效果 干預8周后，與正常組相比，模型組IGF-1 mRNA和MCp-1 mRNA的表達明顯升高(P<0.05)，而Nephrin mRNA的表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組IGF-1 mRNA和MCp-1 mRNA的表達明顯降低(P<0.05)，其中IGF-1 mRNA的表達以雷米普利組最為明顯，MCp-1 mRNA的表達以健脾固腎化瘀湯高劑量組最為明顯；雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組Nephrin mRNA的表達升高(P<0.05)，且以健脾固腎化瘀湯高劑量組更為明顯。詳見表2。

表2 各組大鼠干預8周后的Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA表達水平

3.3 健脾固腎化瘀湯對大鼠Nephrin、MCp-1、IGF-1蛋白表達水平的影響 從圖1和表3可以看出，干預8周后模型組IGF-1和MCp-1蛋白的表達明顯高于正常組(P<0.05)，而Nephrin蛋白的表達則明顯低于正常組(P<0.05)。與模型組相比，雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組IGF-1和MCp-1蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，其中IGF-1蛋白的表達以雷米普利組最為明顯，MCp-1蛋白的表達以健脾固腎化瘀湯高劑量組最為明顯；雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組Nephrin 蛋白的表達顯著升高(P<0.05)，且以健脾固腎化瘀湯中、高劑量組更為明顯。

注：A.正常組；B.模型組；C.雷米普利組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組

表3 各組大鼠腎臟中Nephrin、MCp-1、IGF-1陽性區域的綜合光密度(×103)

3.4 健脾固腎化瘀湯對大鼠腎臟組織病理變化的影響 從圖2可以看出，正常組的腎臟組織表現正常；模型組的腎臟組織細胞增生，細胞排列紊亂，腎小球內的細胞減少；雷米普利組，健脾固腎化瘀煎劑低、中、高劑量組干預后，細胞排列整齊。

4 討論

DKD作為最令人擔憂的糖尿病慢性微血管并發癥之一，是指由糖尿病所致的慢性腎臟結構和功能障礙的疾病，其病變可累及全腎(包括腎小球、腎小管、腎間質等)。早期通常表現為微量白蛋白尿，隨后逐步進展出現大量白蛋白尿、腎小球濾過率進行性下降、血肌酐進行性上升。如果不及時進行治療，將會導致嚴重后果，最終發展為終末期腎衰竭[10]。現代醫學在治療上往往從降糖、降壓、腎素血管緊張素醛固酮系統(RAAS)阻斷、抗氧化、抗炎和改善微循環等方面多因素干預疾病[11]，雖有一定的效果，但大多只是對癥治療，延緩病情，并且在應用如血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)類藥物時易引起干咳、升高血鉀等諸多不良反應，不利于穩定病情，所以說現代醫學仍缺乏有效藥物阻止病情發生發展。

中醫學在治療DKD上歷史悠久，應用廣泛，通過辨證論治和整體治療等方法，在治療DKD上有多靶點、多通路的優勢。其中健脾固腎化瘀湯全方共奏健脾固腎、化瘀通絡之功。其中重用黃芪，以健脾益氣、消腫利尿，補諸虛不足；黨參健脾補氣；熟地黃、山茱萸、山藥、黃精均有補虛益腎之功；芡實、金櫻子固精益腎；白術益氣健脾，茯苓利水淡滲，兩者合用，能夠利水濕從小便去；當歸養血活血；僵蠶、蟬蛻、水蛭用以化瘀通絡[12]。臨床研究中已經證實健脾固腎化瘀湯可顯著改善DKD患者的空腹血糖、餐后2 h血糖、膽固醇、甘油三酯、血壓、24 h尿微量白蛋白水平等[13]，但其作用機制尚不明確，探討其治療機制有利于進一步應用于臨床DKD患者，并為其提供實驗與理論依據。

本項研究中，筆者利用高脂飼料聯合STZ注射制備大鼠的DKD模型，結果顯示，模型組大鼠血清中的尿素氮、甘油三酯和膽固醇以及尿液中的蛋白質水平都有所上升。腎臟的HE染色顯示DKD模型大鼠的腎組織細胞過度增殖和排列紊亂，腎小球細胞減少，這與其他關于DKD的動物研究一致[14]，表明造模成功。本研究結果顯示健脾固腎化瘀湯能夠改善模型大鼠的腎組織細胞，降低IGF-1蛋白和MCp-1蛋白的表達量，提高Nephrin蛋白的表達量，且呈現出劑量依賴的特征。

在糖尿病發病機制的研究中，DKD發生發展與足細胞關系密切[15]。裂孔隔膜作為特有的足細胞間的細胞鏈接，是一種特殊的蛋白質復合物，連接著相鄰的莢膜細胞足突，與DKD蛋白尿的產生密切相關。Nephrin作為裂孔隔膜上的特異性膜蛋白的一種，可通過正式或反式鏈接嗜異性結合，形成順勢異聚體，它的存在能夠使得裂孔隔膜的結構完整，功能正常[16]。眾多實驗[17-18]已經證實Nephrin對裂孔隔膜十分關鍵，同時Nephrin蛋白的減少也會對腎小球的硬化造成一定的影響[19]。在本研究中，模型組大鼠Nephrin蛋白表達減少，健脾固腎化瘀湯組大鼠在低、中、高劑量健脾固腎化瘀湯干預后，Nephrin蛋白的表達量的增加，能夠在一定程度上減輕DKD大鼠的腎臟損傷，延緩疾病的進程。

炎癥反應作為DKD的發病機制之一[20]，近年來受到廣泛關注。MCp-1作為一種C-C型趨化因子，MCp-1對單核細胞有特異的趨化激活作用，能促進炎癥反應的發生[21]。MCp-1是由腎小球系膜細胞和血管內皮細胞等多種細胞進行分泌，從而增加巨噬細胞黏附性，進一步分泌致纖維化細胞因子并加重腎組織的損傷[22]。已有研究證實[23-25]，MCp-1的大量出現會使得腎臟功能受損，同時由于MCp-1在單核巨噬細胞的浸潤和激活中起著重要作用，會進一步加重腎臟損傷。在本研究中，模型大鼠在服用健脾固腎化瘀湯后，MCp-1水平下降，抑制了腎臟中致纖維化細胞因子的表達，降低了血管的通透性，改善了蛋白尿的情況。

IGF-1作為一種多肽神經營養因子，具有與胰島素相似的結構和功能[26]。有研究已經證實IGF-1水平升高與2型糖尿病患者腎臟病變損傷程度保持一致[27-28]，同時IGF-1作為一種新的血漿標志物對于DKD早期診斷及疾病預后發展判定具有一定的臨床意義[29-30]。已有實驗證實IGF-1可促進腎臟系膜細胞產生層黏蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白，使得腎小球硬化，加劇DKD的進程[31]。本研究表明健脾固腎化瘀湯通過降血糖、改善腎小球微循環降低IGF-1含量，以改善腎小球的硬化，保護腎臟。

綜上所述，健脾固腎化瘀湯對DKD的腎臟有很好的改善和保護作用，其作用機制可能與調控Nephrin mRNA、MCp-1、IGF-1的表達有關，為其臨床應用提供了理論基礎。然而仍有不足，本研究只是在一定程度上揭示了健脾固腎化瘀湯治療DKD的作用機制，其具體的通路、靶點的研究仍是研究的重點方向。