葛根芩連湯降低TNF-α 水平改善小鼠潰瘍性結腸炎機制研究

李 靜 王思晗 鄒新麗 胡晨旻 虞燕萍 蔣春明

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不明確的慢性、易復發的腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）兩種主要臨床類型之一[1]。UC 好發于結腸遠端靠近直腸的部位，病理表現為局限于黏膜及黏膜下層的連續性淺表性潰瘍[1]。根據UC 的臨床嚴重程度，治療上常采用5-氨基水楊酸、皮質類固醇、硫嘌呤類藥物和分子靶向藥物等。由于藥物療程長、副作用大、價格昂貴，且病情容易反復進展，一定程度限制了臨床應用[2]。當藥物治療無效或者發生急性重型UC 時，可采取手術治療[3]。葛根芩連湯始載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》，以清熱、堅陰、止痢為主，兼有透表、解表清里之功，臨床上可治療泄瀉腹痛、感冒發熱等。本研究采用自由飲用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立小鼠急性UC 模型，研究葛根芩連湯對其病理損傷和血清炎癥因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 體質量20～24 g 的C57BL/6 小鼠34只，6～8 周齡，雄性，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002。小鼠在浙江中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0012。環境溫度（22±1）℃，保持12∶12 h 光-暗循環、自由進食飲水，適應性飼養1 周。本實驗由浙江中醫藥大學動物倫理中心批準實施（倫理批準編號：IACUC-20201130-10）。

1.2 藥品與試劑 DSS（美國MP Biomedicals 公司，相對分子質量36000～50000，批號S0798 和Q7418，貨號160110）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業有限公司，批號09201121）；葛根芩連丸（廣西壯族自治區花紅藥業股份有限公司，批號2020202）；小鼠IL-1β 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南通飛宇生物科技有限公司，貨號MM-0040M2）；小鼠TNF-α ELISA 試劑盒（南通飛宇生物科技有限公司，貨號MM-0132M2）。

1.3 主要儀器 Thermo 905 系列超低溫冰箱（上海百基生物科技有限公司）；RM2255 全自動輪轉切片機（Leica Microsystems，Inc）；Beckman Allegra X-15R 高速臺式冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 藥物混懸液配制 參考臨床治療劑量，按人-小鼠等效劑量折算[4]，用蒸餾水配制柳氮磺吡啶混懸液260 mg/kg（相當于臨床劑量成人2 g/70 kg）和葛根芩連湯混懸液390mg/kg（相當于臨床劑量成人3g/70 kg）。

2.2 動物分組、造模與給藥 小鼠適應性喂養1 周后采用隨機數字表法分為四組：空白組8 只、模型組10 只、柳氮磺吡啶組8 只和葛根芩連湯組8 只，標記后稱重。根據文獻[2]采用DSS 自由飲用法誘導UC小鼠模型：除空白組外，其余各組小鼠予以2.5%DSS（分子量36000～50000）溶液代替飲用水供其飲用，隔3 d 更換1 次，連續6 d。在造模第5 天起柳氮磺吡啶組和葛根芩連湯組分別給予相應藥物灌胃（給藥容量為10 mL/kg），空白組和模型組灌胃等體積飲用水，每天1 次，持續6 d。

2.3 觀察指標

2.3.1 小鼠一般情況觀察 造模之日起，每天觀察并記錄食物的攝入量、小鼠體質量、糞便情況、精神狀況等。參考文獻進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分[5]：（1）糞便性狀：正常成形便計0分，不黏附于肛門的糊狀半成形大便計2 分，可黏附于肛門的稀水樣便計4 分。（2）便血：肉眼無血便計0分，肉眼血便計4 分。（3）體質量減輕的百分比：0≤體質量下降＜1%計0 分；1%≤體質量下降＜5%計1分；5%≤體質量下降＜10%計2 分；10%≤體質量下降＜15%計3 分；體質量下降≥15%計4 分。DAI=（糞便性狀+便血+體質量減輕的百分比）/3。

2.3.2 小鼠結腸長度測量、結腸組織病理學檢測實驗結束后，頸椎脫臼法處死小鼠，鈍性分離結腸組織，觀察結腸形態并測量長度。將結腸組織放入10%的中性甲醛中固定24 h 以上，經過梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm），并附于高粘附載玻片上，烘干，次日進行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察結腸組織形態學評估結腸病理損傷，進行組織學評分[5]：（1）炎癥反應：無計0 分，輕度計1 分，中度計2 分，重度計3 分。（2）病變累及深度：無計0分，黏膜下層計1 分，肌層計2 分，漿膜層計3 分。（3）隱窩破壞：無計0 分，基底1/3 隱窩被破壞計1 分，基底2/3 隱窩被破壞計2 分，全部隱窩被破壞，但有完整上皮計3 分，全部隱窩及完整上皮被破壞計4 分。（4）病變范圍：＜1%計0 分，1%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，76%～100%計4 分。

2.3.3 小鼠血清炎癥因子IL-1β 和TNF-α 測定 摘眼球法取小鼠血液，常溫靜置30 min，于3000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存待測。使用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清IL-1β 及TNF-α 的含量，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.4 統計學方法 應用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料符合正態分布者以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊用LSD 檢驗進行兩兩比較，方差不齊用Tamhane's T2 檢驗進行兩兩比較。多組間存活率比較用卡方檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 不同組模型小鼠一般情況 空白組小鼠整體表現正常，體質量穩步增加，精神狀態良好。其余各組小鼠在造模后第3 天起出現明顯攝食減少、喜扎堆嗜睡，背毛蓬松粗糙且無光澤，體質量顯著下降，并出現大便溏稀、血便。與空白組比較，模型組DAI 評分顯著升高（P＜0.05）；經葛根芩連湯治療后，葛根芩連湯組小鼠DAI 評分比治療前明顯下降，但與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。柳氮磺吡啶組小鼠在第7、10 天各死亡1 只，葛根芩連湯組小鼠在第8 天死亡1 只，各組存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質量、DAI 評分及存活率比較（）

表1 各組小鼠體質量、DAI 評分及存活率比較（）

注：空白組予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃；模型組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液造模基礎上予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺吡啶組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩連湯組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎上予葛根芩連湯（390 mg/kg）灌胃；DAI 為疾病活動指數；“-”為無此項結果；與空白組比較，aP＜0.05

3.2 不同組模型小鼠結腸組織病理學改變

3.2.1 不同組模型小鼠結腸組織大體形態 空白組小鼠結腸黏膜表面光滑，無充血，無腫脹，無糜爛與潰瘍；模型組結腸變短（P＜0.05），腸壁增厚，結腸黏膜充血水腫，伴有糜爛，腸腔內有不成形糞便；柳氮磺吡啶組、葛根芩連湯組小鼠結腸也可見不同程度的損傷，結腸長度和腸黏膜充血水腫情況有所改善，腸腔可見成形糞便，結腸長度與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1 和表2。

圖1 葛根芩連湯對UC 小鼠結腸長度影響

3.2.2 不同組模型小鼠結腸組織鏡下觀察 對各組小鼠結腸遠端組織進行HE 染色，結果顯示，空白組小鼠結腸上皮細胞完整，腺體排列整齊，未見炎癥細胞浸潤和潰瘍形成；模型組上皮細胞損傷，腺體排列紊亂、破壞甚至消失，隱窩結構改變，炎癥細胞浸潤形成隱窩膿腫及潰瘍，病變深度嚴重時可全累及漿膜層，組織學評分與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；柳氮磺吡啶組和葛根芩連湯組炎癥細胞浸潤深度及數量減少，上皮完整性、腺體排列改善，但組織學評分與模型組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2 和圖2。

表2 各組小鼠結腸長度和組織學變化評分比較（）

表2 各組小鼠結腸長度和組織學變化評分比較（）

注：空白組予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃；模型組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液造模基礎上予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺吡啶組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩連湯組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎上予葛根芩連湯（390 mg/kg）灌胃；與空白組比較，aP＜0.05

圖2 葛根芩連湯對UC 小鼠組織病理學變化的影響（HE 染色，×200）

3.3 不同組模型小鼠血清炎癥因子水平比較 與空白組比較，模型組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，葛根芩連湯組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平則明顯下降，其中TNF-α水平差異具有統計學意義（P＜0.05）；與柳氮磺吡啶組比較，葛根芩連湯組小鼠血清TNF-α 下降明顯（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

表3 各組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

注：空白組予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃；模型組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液造模基礎上予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；柳氮磺吡啶組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎上予柳氮磺吡啶溶液（260 mg/kg）灌胃；葛根芩連湯組自由飲用2.5%DSS 溶液造模基礎上予葛根芩連湯（390 mg/kg）灌胃；IL-1β 為白介素-1β；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柳氮磺吡啶組比較，cP＜0.05

4 討論

UC 作為一種復發-緩解交替的進行性發展的慢性結腸炎癥性疾病，可累及肌肉骨骼、眼部和皮膚等多系統多臟器功能損害。目前UC 尚無根治辦法，主要依靠抗炎藥物來誘導緩解和維持治療[3]。傳統中醫藥根據“未病先防、既病防變、瘥后防復”的治療原則，可在UC 病情發展不同階段進行干預[6]。葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連和甘草四味中藥配伍而成，作為經典古方，主要治療太陽表邪內陷所致的熱下利證。葛根芩連湯加減方或聯合西藥柳氮磺吡啶在臨床上可作為UC 患者的一種治療選擇[7]，但由于中藥復方組成的復雜性及作用機制的不確定性，一定程度限制該方的臨床應用。新近研究發現，葛根芩連湯具有調節腸道菌群、修復受損腸黏膜以及維持腸道穩態等功能[8-11]。本研究結果顯示，葛根芩連湯可以顯著改善UC 小鼠結腸充血水腫，修復腸道組織損傷，促進潰瘍愈合，證實葛根芩連湯對UC 動物模型具有一定療效。

細胞因子具有調控腸道炎癥，介導腸道免疫，維持腸道穩態的作用，在UC 的發病機制中發揮關鍵作用。TNF-α 和IL-1β 是急性UC 早期的重要促炎因子，可以通過招募并活化免疫細胞如T 細胞、先天淋巴細胞（innate lymphoid cells，ILCs）等誘發腸道免疫反應，造成局部炎癥[12]。TNF-α 通過與受體TNFR1和TNFR2 結合，發揮多種促炎功能，如使腸上皮細胞和潘氏細胞死亡，破壞腸道屏障；招募巨噬細胞浸潤，從而分泌IL-1、IL-6 等促炎因子，抑制效應T 細胞凋亡發揮持續促炎作用等，從而參與UC 的發生發展[12]。同時，由CD14+巨噬細胞編碼產生IL-1β，可與TNF-α、IL-6 和IL-23 共同誘導CD4+T 細胞分化為Th17，進而分泌更多TNF-α[1]。本研究結果顯示，UC動物模型的血清TNF-α、IL-1β 表達水平顯著升高，葛根芩連湯治療可顯著降低UC 動物模型血清TNF-α 表達水平（P＜0.05），而不影響IL-1β 表達水平，提示作為UC 早期腸道炎癥指標的TNF-α 可能是葛根芩連湯發揮效應的分子靶點之一。在治療糖尿病機制研究中發現，葛根芩連湯可抑制Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和磷脂酰肌醇三羥基激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/雷帕霉素機械靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）信號通路來降低血清TNFα 的水平[9-10]，我們猜測葛根芩連湯在UC 模型中也存在相似通路來抑制TNF-α，需要進一步研究加以驗證。既往文獻報道，葛根芩連湯在遲發性腹瀉模型中可顯著降低IL-1β 水平[13]，而本實驗結果顯示葛根芩連湯不能顯著降低UC 模型的IL-1β 表達水平，我們推測可能與研究所用的方劑組成、實驗處置不同有關。

綜上所述，葛根芩連湯具有改善UC 模型小鼠的臨床表現及結腸病理學損害的作用，可能通過抑制TNF-α 的表達來發揮藥理作用。葛根芩連湯含有葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸等多種中藥活性成分[14]，它們對UC 免疫調節的機制、通路、靶點仍不清楚，因此今后將進一步深入研究揭示葛根芩連湯調節TNF-α 治療UC 的潛在作用機制及鑒定可能的有效單體成分，為傳統中醫藥臨床治療UC 提供實驗依據。