基于UPLC-QE-MS 技術的暢脈樂膠囊化學成分分析及其抗腦血栓的網絡藥理學研究

翁一玲 李煌 卓辰茜 劉婉婷 陳松旺

腦血栓是腦梗死常見類型之一,其發病急,病情進展迅速,致死風險較高,發病率逐年增加,并呈現年輕化趨勢,故臨床上需對腦血栓予以積極治療［1］。西醫多采用溶栓治療加腦神經保護,可在一定程度上緩解腦血栓癥狀。近年來,中西醫結合治療腦血栓取得了良好的進展,中藥多選擇活血化瘀方藥［2,3］。暢脈樂膠囊是福建省第二人民醫院根據陳美華主任的多年經驗研制的院內制劑,具有滋腎活血、祛風通絡的功效。該處方由黃芪、丹參、郁金、赤芍、葛根等多味中藥組成,方中黃芪補中益氣,丹參通利血脈,赤芍涼血散瘀,郁金、葛根有助于在活血祛瘀通絡的同時不傷正氣。全方兼備攻補,共同發揮活血益氣功效。目前,暢脈樂膠囊在臨床上常用于防治中老年血管硬化或腦卒中后遺癥［4,5］。在中藥的質量控制方面,目前研究主要集中于某一種或幾種標記化合物的定量分析。中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點已被廣泛認識,但是,從數以萬計成分的復雜中藥體系中獲取有用的化學信息一直是研究人員面臨的挑戰。UPLC-QE-MS 具有高分辨率和靈敏度,已成功用于復雜樣品的分析,以此可以作為一種快速、全面地識別中藥化學成分的策略［6］。近年來,網絡藥理學作為一種高通量篩選,運用網絡可視化及網絡分析等多種技術,已經廣泛用以揭示藥物、靶點、疾病間復雜的網絡關系,從多維度理解藥物的作用機制,這為中藥研究中的多成分多靶點作用機制研究提供新的研究思路［7］。本研究采用UPLCQE-MS 技術對暢脈樂膠囊化學成分快速分析,并進行其抗腦血栓的網絡藥理學研究,旨在為院內制劑質量評價和闡明其藥效作用機制提供科學依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 Vanquish 型超高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 120 型高分辨質譜(購自美國賽默飛世爾科技公司)；BSA124S-CW 型天平(德國賽多利斯公司)；JXFSTPRP-24 型研磨儀(上海凈信科技有限公司)；明澈 D24 UV 性純水儀(默克密理博公司)；YM-080S 型超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)；色譜柱(100×2.1 mm,1.7 μmWaters ACQUITY UPLC BEH C18)。

1.2 試劑 暢脈樂膠囊(規格：0.5 g/粒,批號：20211224,由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院制劑室提供)；甲醇、乙腈(色譜純,均購自CNW Technologies)；甲酸(色譜純,購自美國SIGMA 公司)；L-2-氯苯丙氨酸(純度≥98%,購自上海恒柏生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 暢脈樂膠囊化學成分定性分析

1.3.1.1 色譜條件與質譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm,1.7 μm)；流動相0.1% 甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～3.5 min,5%～15% B；3.5～6.5 min,15%～30% B；6.5～12.5 min,30%～70% B；12.5～25.0 min,70%～100% B；25～30 min,100%～5% B),體積流量400 μl/min;柱溫為40 ℃；進樣量5 μl；進樣室溫度4℃。

Orbitrap Exploris 120 質譜儀能夠在控制軟件(Xcalibur,Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScanddMS2 功能進行一級、二級質譜數據采集。具體參數：鞘層氣體流速30 Arb；輔助氣體流速10 Arb；離子傳輸管溫度 350℃；蒸發器溫度350℃；全ms 分辨率 60000；ms/ms 分辨率15000；NCE 模式碰撞能量：16/38/42；噴射電壓：5.5 kV(正)或-4 kV(負)。

1.3.1.2 暢脈樂膠囊的前處理 稱取100 mg 的暢脈樂膠囊內容物,加入500 μl 提取液(甲醇∶水=4∶1,內標濃度為10 μg/ml)；渦旋30 s,45 Hz 勻漿4 min,冰水浴超聲1 h；-40 ℃靜置1 h 后將樣本4 ℃,12000 rpm［離心力13800(×g),半徑8.6 cm］離心 15 min；小心取上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾；轉移到自動進樣瓶中,用于UPLC-QE-MS 分析。

1.3.1.3 數據處理與分析 原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML 格式后,使用XCMS 軟件將質譜原始導入,進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作,利用自建二級質譜數據庫及相應裂解規律匹配對含有MSMS 數據庫進行物質鑒定。

1.3.2 暢脈樂膠囊網絡藥理學分析

1.3.2.1 暢脈樂膠囊有效成分代謝靶點的獲取 通過檢索 TCMSP 數據庫 (http://tcmspw.com/tcmsp.php)得到暢脈樂膠囊組方中葛根、丹參、郁金、赤芍和黃芪的所有活性成分,將口服生物利用度(OB) 設為＞30%,類藥性(DL)設為＞0.18 篩選及統計出暢脈樂膠囊的有效成分。同時篩選出有效靶點,導入Uniprot 數據庫進行標準化處理。

1.3.2.2 腦血栓治療靶點的獲取 運用 GeneCards 數據庫(https://www.genecards.org/),以“Cerebral Thrombosis”為主題詞進行相關檢索,查得腦血栓治療靶點,將結果導入EXCEL 表格中分析處理,并建立數據集。

1.3.2.3 成分-靶點相互作用網絡的建立 為了更明確、清晰地闡述暢脈樂膠囊抗腦血栓的作用機制,利用在線韋恩圖Venny2.1 繪制韋恩圖Venn Diagram,得到交集靶點。整理后的藥物有效成分與靶點交集靶點導入Cytoscape3.7.2 軟件中,獲得成分-靶點相互作用網絡圖。

1.3.2.4 靶點GO 功能分析以及KEGG 通路富集分析將上述已獲得的關鍵靶點基因轉化為基因ID,運用GO (http://www.geneontology.org/) 進行功能注釋以及富集分析,同時對相關靶點利用KEGG 網站搜索數據庫提供的繪圖模塊進行靶點蛋白渲染。

1.3.2.5 靶點蛋白的PPI 網絡構建分析 把上述獲得的交集靶點輸入STRING 數據庫構建靶點蛋白的網絡互作圖。加入代謝物與靶點蛋白節點關系、靶點蛋白與通路節點關系,進一步闡述暢脈樂膠囊抗腦血栓的代謝物-靶點-通路的網絡構建分析。

2 結果

2.1 暢脈樂膠囊化學成分定性分析結果 研究結果表明：在Composite Score ＞0.99 的情況下,暢脈樂膠囊的正離子模式共鑒定成分79 個,負離子模式共鑒定成分47 個。見圖1。正負離子模式下暢脈樂膠囊鑒定出的化學成分可分為20 種類型,分別是氨基酸衍生物、苯及取代衍生物、脂肪酸類、脂肪酰類、黃酮類、寡糖類、酚類、糖類多酮類、苯丙素類、萜類、生物堿、酰胺類、香豆素及其衍生物類、二萜類、神經遞質類、有機酸及其衍生物、酚醚類、有機羥基化合物、異戊烯醇脂類及其他類。

圖1 暢脈樂膠囊UPLC-QE-MS 檢測正(A)、負離子(B)模式TIC 圖

2.2 暢脈樂膠囊有效成分作用靶點及有效成分-疾病-作用靶點篩選 經過檢索,得到暢脈樂膠囊復方中的有效成分對應靶點577 個,在GeneCards 數據庫中查得腦血栓形成靶點共2284 個。將有效成分靶點與腦血栓形成靶點取交集,共得到267 個交集靶點,見圖2。具體靶點見表1。

表1 藥物-疾病有效交集靶點

圖2 有效成分靶點-藥物靶點韋恩圖

2.3 GO 功能分析以及KEGG 分析結果 將上述過程中獲得的相應靶點導入GO 數據庫進行功能富集性分析,得到生物過程(BP)3316 個、細胞組分(CC)163 個、分子功能(MF)434 個條目,包括蛋白質自磷酸化、對有毒物質的反應、肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾對氧化應激的反應、對異種刺激的反應等生物過程起作用。GO 分析各分類排名前五結果見表2。KEGG 通路富集分析得到194 條相關通路,其中富集程度顯著的有脂質和動脈粥樣硬化、神經活性配體-受體相互作用信號通路、鈣信號通路、炎癥介質對TRP通道的調節及HIF 信號通路等。KEGG 通路富集分析靶點蛋白個數排名前五結果見表3。

表2 GO 分析暢脈樂膠囊抗腦血栓關鍵靶點各分類排名前五結果

表3 KEGG 代謝通路富集分析暢脈樂膠囊靶點蛋白個數排名前五結果

2.4 靶點蛋白的PPI 網絡構建分析 運用STRING 數據庫,輸入藥物靶點與疾病靶點數據集中相交的267 個有效靶點,手動設定物種為“Homo sapiens”。利用靶點蛋白之間相互關系構建靶點蛋白可視化互作網絡。鏈接節點最多的20 個靶點基因見圖3,這些靶點可能是暢脈樂膠囊作用于腦卒中的核心靶點。

圖3 蛋白互作網絡中 20 個核心基因

3 討論

腦血栓作為一種常見的心腦血管疾病,多因大腦供血不足,導致血液粘度升高,凝血因子聚集形成血栓堵塞血管,引起側支循環不暢,進而造成神經功能損傷。而暢脈樂膠囊能夠調節血管舒張功能,從而修復血管內皮損傷,對腦血栓具有治療作用。

本研究利用UPLC-QE-MS 技術對暢脈樂膠囊化學成分進行定性分析,得到20 種化學成分,包括黃酮類、萜類、苯丙素類等。黃酮類化合物主要通過抗炎抗氧化,抑制血小板活化和相關信號轉導,改善血腦屏障通透性和血液流變學,對腦缺血再灌注損傷具有保護作用［8］。暢脈樂膠囊處方中君藥黃芪的主要活性成分槲皮素、山萘酚為黃酮類靶點較多的有效成分,黃芪甲苷為萜類靶點較多的有效成分,主要通過減少腦部缺血組織細胞的凋亡、抑制炎癥反應、抑制血小板活性等減輕神經功能的損傷［9］。萜類靶點較多的成分還有芍藥苷、大豆皂苷等。芍藥苷可顯著降低腦缺血大鼠的神經功能缺損評分,改善神經功能損傷［10］。丹參的有效成分較多,如苯丙素類的丹酚酸、丹參素,二萜類的丹參酮等,通過抑制炎性反應及細胞凋亡發揮神經保護作用［11,12］。

本研究通過構建有效成分-靶點-疾病相互作用網、韋恩圖以及PPI 網絡圖得到暢脈樂膠囊抗腦血栓形成的交集靶點267 個,TP53、AKT1、TNF、IL-6 等可能為核心靶點。研究發現,TP53 是程序性細胞死亡、細胞周期、DNA 修復和基因組穩定血管生成和轉移的抑制及其他功能的關鍵調節劑［13］。AKT1 調節幾個關鍵的內皮細胞和血管平滑肌細胞功能,包括細胞生長、遷移、存活和血管張力,AKT1 的缺失會導致嚴重的動脈粥樣硬化和閉塞性冠狀動脈疾病［14,15］。TNF-α 是常見的炎癥因子之一,炎癥反應會提高血腦屏障的通透性,使大量炎性因子如白細胞介素IL-6、IL-1β 等進入腦內,最終導致腦組織損傷。這幾個核心靶點與細胞凋亡信號通路、炎癥反應、神經調節等相關,暢脈樂膠囊的活性成分槲皮素、山奈酸、丹參酮、木犀草素、芍藥苷等明顯降低大鼠腦組織TNF-α、IL-6及IL-1β 含量,抑制炎癥反應［16,17］,體現了暢脈樂膠囊多靶點抗腦血栓,同一靶點又受多個化合物調控的作用特點。

通過對關鍵靶點進行GO 分析和KEGG 通路富集分析可知,暢脈樂膠囊主要作用于Wnt 通路、PI3KAkt 通路、MAPK 通路及脂質和動脈粥樣硬化等信號通路,通過調節血管內皮功能,抑制炎癥反應,促使神經功能恢復。Wnt 通路是目前研究最為廣泛且較成熟的一條信號通路,在細胞增殖、分化及凋亡等階段均有重要的作用。黃芪甲苷可通過Wnt/β-catenin 通路、Akt-mTOR 通路改善大鼠腦缺血再灌注損傷［18,19］。木犀草素、丹參酮Ⅱ等通過調節PI3K-Akt 信號通路,干預缺血性腦卒中,發揮抗炎、抑制細胞凋亡、神經保護等作用［20］。謝勝偉等［5］的研究結果顯示暢脈樂膠囊可抑制Wnt 通路中關鍵激酶的活性,降低內皮細胞中Wnt1、β-catenin、dvl-1 的表達,改善動脈粥樣硬化程度。上述已有研究與本研究結果一致,體現了暢脈樂膠囊可通過多靶點、多通路發揮對腦卒中后損傷的內皮細胞增殖、神經血管保護的調控作用。

綜上所述,本研究采用UPLC-QE-MS 技術定性了暢脈樂膠囊中的主要化學成分,并結合網絡藥理學方法探索了暢脈樂膠囊抗腦血栓的作用機制。網絡藥理學的整體性、系統性和注重藥物間相互作用的特點與中醫藥學的“多成分、多靶點、多途徑”的特點相吻合,符合中醫藥對疾病本質的認識,為研究傳統中藥與現代藥理學之間的相互關系搭建了橋梁。