阿昔莫司對脂多糖誘導膿毒癥大鼠心肌損傷及Nrf2/HO-1 信號通路的影響

黃泓軻，羅健瑋，冉華

心臟是膿毒癥最主要的受累器官，有超過70%的膿毒癥動物發生心功能障礙，并導致死亡[1-2]。研究認為，膿毒癥心肌損傷的發病機制涉及心肌細胞凋亡、自主神經失調、能量代謝及心肌抑制因子等多種因素[3]。革蘭氏陰性菌細胞壁中的脂多糖可作膿毒癥的主要致病因素，引起全身炎癥反應，造成機體多組織、多器官繼發性損傷[4]。目前研究發現，脂多糖刺激機體組織后，組織供能失衡引起脂質代謝紊亂、脂質毒性物質釋放及積累，可激活氧化應激及炎癥反應途徑，加劇心肌組織細胞損傷及凋亡[5]。研究發現，阿昔莫司聯合瑞舒伐他汀可改善心肌酶譜[6]。研究證實，阿昔莫司發揮抗炎、抗氧化應激、抗凋亡的重要通路核因子E2 相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1），參與心肌組織細胞損傷后修復過程[7]。但阿昔莫司能否改善膿毒癥心肌損傷及相關作用機制還未見明確報道。基于此，本研究應用脂多糖誘導建立了大鼠膿毒癥模型，初步探究阿昔莫司對膿毒癥大鼠心肌損傷的影響及Nrf2/HO-1 通路在此過程中扮演的角色，以期為阿昔莫司在膿毒癥領域的治療應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只SD大鼠，雌雄不限，清潔級，體重200～220 g，6～8 周齡，購自四川省人民醫院實驗動物研究所。本實驗經本院動物倫理委員會批準[批準號：IACUC-01（20200102）]，嚴格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑及儀器

阿昔莫司（規格100 mg）購自上海喬羽生物科技有限公司；脂多糖（來源于大腸桿菌 0111：B4）、Nrf2通路抑制劑全反式維甲酸（ATRA）（HPLC ≥98%）購自美國Sigma 公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）ELISA 試劑盒分別購自無錫云萃生物科技有限公司、上海研生實業有限公司與上海賽可銳生物科技有限公司；總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒均購自江西艾博因生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）ELISA 試劑盒分別購自上海冠導生物工程有限公司和上海圻明生物科技有限公司；Nrf2、HO-1、核因子-κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、過氧化氫酶（CAT）、A 類清道夫受體（SR-A）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）等兔抗大鼠抗體均購自美國Abcam 公司；DM2500 熒光顯微鏡購自德國徠卡。

1.3 大鼠膿毒癥模型建立及分組給藥

取40 只大鼠，參照文獻[8]經大鼠腹腔注射脂多糖5 mg/kg 建立膿毒癥模型，造模成功大鼠隨機分為模型組、阿昔莫司組、ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組，每組10 只。另取10 只大鼠，腹腔注射等量生理鹽水，作為正常對照組。

各組大鼠均于脂多糖注射6 h 后，開始給藥（記為給藥第0 天），阿昔莫司組參照文獻[9]灌胃給予32 mg/kg 阿昔莫司；ATRA 組腹腔注射給予ATRA（0.2 mg/kg，給藥3 d）[10]；阿昔莫司+ATRA 組灌胃給予阿昔莫司的同時，腹腔注射ATRA，阿昔莫司與ATRA 劑量同前；模型組及正常對照組灌胃并腹腔注射給予等量生理鹽水。連續給藥3 d 后，統計大鼠成活只數，并同時取血和獲取心肌組織。

1.4 ELISA 法檢測大鼠血清心肌損傷標志物及血脂水平變化

取各組大鼠腹主動脈血6 ml，血液生化分析儀檢測心肌損傷標志物CK、LDH、cTnI 水平；按ELISA 法測血脂相關指標TC、HDL-C、LDL-C、TG、FFA 水平。

1.5 ELISA 法檢測大鼠心肌組織氧化應激及炎癥因子水平

大鼠處死，摘取心肌組織剪碎后勻漿，勻漿液ELISA 法測心肌組織中氧化應激產物MDA、ROS 水平及炎癥因子IL-6、TNF-α 水平，剩余心肌組織，一部分置于-80 ℃冰箱保存備用；另一部分置于多聚甲醛中固定，制成石蠟切片，備用。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色及TUNEL 染色法測心肌組織損傷及心肌細胞凋亡情況

取已制備石蠟切片，進行染色封片后置于光鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6 軟件系統測TUNEL 染色切片中單位面積內被染成紅棕色的凋亡細胞數目，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數目/總細胞數目×100%，統計分析細胞凋亡情況。

1.7 免疫熒光染色法檢測心肌組織的細胞核中Nrf2陽性表達水平

取已制備石蠟切片，脫蠟、水化、透化及抗原修復后，加入一抗，4 ℃孵育過夜后，加入二抗孵育2 h，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染后，Image-Pro Plus 5.0 圖像分析系統分析單位面積內Nrf2 在細胞核中陽性染色的平均光密度值。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測細胞HO-1、NF-κB、p-NF-κB、SOD2、CAT、LPL、PPARα、SR-A 蛋白表達

取冰箱中保存的心肌組織，裂解、勻漿，軸提胞漿蛋白及核蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取50 μg蛋白行電泳、轉膜反應，加入一抗，內參β-肌動蛋白（β-actin），4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶二抗（1：800）室溫孵育1 h，增強化學發光法顯影曝光，化學發光成像儀拍照，Image J 分析系統進行半定量分析。

1.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 8 及SPSS 24.0 進行統計分析。數據用均數±標準差表示，多組間比較及進一步兩兩比較分別用單因素方差分析及SNK-q 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般行為

正常對照組大鼠無死亡，飲食、活動及精神狀態正常。模型組大鼠死亡2 只，飲食及活動量減少，呼吸加快、豎毛、精神萎靡、稀水樣排便行為增加。阿昔莫司組大鼠無死亡，飲食及活動量有所增加，大部分呼吸較為平緩，豎毛、精神萎靡癥狀緩解，糞便較為濃稠。ATRA 組死亡4 只，飲食及活動量進一步減少，精神萎靡及稀水樣排便癥狀進一步加重。阿昔莫司+ATRA 組死亡2 只，飲食、活動量、精神萎靡、豎毛、呼吸加快、稀水樣排便癥狀重于阿昔莫司組，但輕于ATRA 組，并與模型組相近。

2.2 各組大鼠心肌損傷標志物、血脂指標、氧化應激產物及炎癥因子的比較

與正常對照組相比，模型組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平升高，TC、HDL-C、LDL-C 水平降低，TG、FFA 水平升高，MDA、ROS、IL-6、TNF-α水平升高，P均＜0.05。與模型組相比，阿昔莫司組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平降低，TC、HDL-C、LDL-C 水平升高，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平降低，P均＜0.05；ATRA 組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平升高，TC、HDL-C、LDL-C 水平進一步降低，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平進一步升高，P均＜0.05。與阿昔莫司組相比，ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組血清CK、LDH、cTnI 水平升高，TC、HDL-C、LDL-C 水平降低，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平升高，P均＜0.05。與ATRA 組相比，阿昔莫司+ATRA 組血清CK、LDH、cTnI 水平降低，而TC、HDL-C、LDL-C 水平升高，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平降低，P均＜0.05，見表1。

表1 各組大鼠心肌損傷標志物、血脂指標、氧化應激產物及炎癥因子水平及Nrf2 下游抗氧化、抗炎、脂質代謝相關通路蛋白表達的比較（）

表1 各組大鼠心肌損傷標志物、血脂指標、氧化應激產物及炎癥因子水平及Nrf2 下游抗氧化、抗炎、脂質代謝相關通路蛋白表達的比較（）

注：Nrf2：核因子E2 相關因子2；ATRA：全反式維甲酸；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；cTnI：心肌肌鈣蛋白I；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；TG：甘油三酯；FFA：游離脂肪酸；MDA：丙二醛；ROS：活性氧簇；IL-6：白細胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；HO-1：血紅素加氧酶-1；SOD2：超氧化物歧化酶2；CAT：過氧化氫酶；p-NF-κB：磷酸化NF-κB；NF-κB：核因子-κB；β-actin：β-肌動蛋白；LPL：脂蛋白脂肪酶；SR-A：A 類清道夫受體；PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α。與正常對照組比*P＜0.05，與模型組比△P＜0.05，與阿昔莫司組比▲P＜0.05，與ATRA 組比◇P＜0.05

2.3 各組大鼠心肌損傷及心肌細胞凋亡情況（圖1）

圖1 各組大鼠心肌組織蘇木素-伊紅染色及TUNEL 染色圖（×400）

HE 染色可見，正常對照組大鼠心肌組織細胞排列整齊，橫紋清晰，結構正常；模型組大鼠可見心肌纖維斷裂、間隔增寬、紅細胞滲出明顯。TUNEL 染色可見，正常對照組大鼠心肌細胞僅有少量被染成紅棕色，細胞凋亡較少；模型組大鼠可見細胞紅棕色染色加深，細胞凋亡增加。

與正常對照組相比，模型組大鼠心肌纖維斷裂、炎性細胞浸潤等病理損傷加重，心肌細胞凋亡率升高[（0.20±0.00）% vs.（1.69±0.25）%，P＜0.05]。與模型組相比，阿昔莫司組上述病理損傷緩解，心肌細胞凋亡率降低[（1.69±0.25）% vs.（1.09±0.45）%，P＜0.05]；ATRA 組心肌損傷進一步加重，心肌細胞凋亡率進一步升高[（1.69±0.25）%vs.（2.66±0.51）%，P＜0.05]。與阿昔莫司組相比，ATRA 組[（1.09±0.45）% vs.（2.66±0.51）%]、阿昔莫司+ATRA 組[（1.09±0.45）% vs.（1.66±0.42）%]心肌細胞凋亡率升高（P均＜0.05），心肌損傷加重。與ATRA 組相比，阿昔莫司+ATRA 組心肌損傷減輕，心肌細胞凋亡率降低[（2.66±0.51）% vs.（1.66±0.42）%，P＜0.05]。

2.4 各組大鼠心肌組織的細胞核中Nrf2 表達（圖2）

圖2 各組大鼠心肌組織細胞Nrf2 免疫熒光染色圖（×400）

免疫熒光染色可見，Nrf2 在正常對照組大鼠心肌組織的細胞核中呈弱陽性表達，在模型組呈強陽性表達且高于正常對照組[（1.02±0.10）mm2vs.（0.26±0.01）mm2]，在阿昔莫司組陽性表達進一步升高且高于模型組[（1.89±0.18）mm2vs.（1.02±0.10）mm2]，在ATRA 組陽性表達減弱并低于模型組[（0.42±0.04）mm2vs.（1.02±0.10）mm2]與阿昔莫司組[（0.42±0.04）mm2vs.（1.89±0.18）mm2]，在阿昔莫司+ATRA 組陽性表達也減弱且低于阿昔莫司組[（1.03±0.09）mm2vs.（1.89±0.18）mm2]，P均＜0.05。

2.5 各組大鼠心肌組織Nrf2 下游抗氧化、抗炎相關通路及脂質代謝相關通路相關蛋白的表達（圖3～4、表1）

圖3 各組大鼠心肌組織HO-1、SOD2、CAT、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達免疫印跡圖

與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織HO-1、SOD2、CAT、p-NF-κB/NF-κB 及LPL、SR-A、PPARα 的蛋白表達均升高（P均＜0.05）。與模型組相比，阿昔莫司組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達進一步升高（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達降低（P均＜0.05）；ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達降低（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL的蛋白表達升高（P均＜0.05）。與阿昔莫司組相比，ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達降低（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達升高（P均＜0.05）。與ATRA 組相比，阿昔莫司+ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達升高（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達降低（P均＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織LPL、SR-A、PPARα 蛋白表達免疫印跡圖

3 討論

研究證實，脂多糖刺激后，心肌組織發生氧化應激及炎癥反應是膿毒癥的主要病理機制[11-13]。Wang 等[14]及李波等[15]通過體內外實驗研究發現，脂多糖可誘導心肌細胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統激活，并促進ROS 在心肌細胞內釋放及積聚。本研究發現，模型大鼠心肌組織中發生氧化應激、炎性反應及細胞凋亡現象。Wang等[16]認為血脂水平的改變是引起膿毒癥全身炎癥反應增加的潛在因素；許青宗等[17]認為膽固醇下降可引起炎性反應失控及組織損傷加重，進而加劇膿毒癥病情惡化進程。LPL 能夠水解細胞外TG釋放出FFA，使胞內FFA 增加，而加劇心肌損傷。本研究結果提示膿毒癥心肌損傷大鼠出現脂質代謝紊亂現象。

鑒于膿毒癥心肌損傷大鼠存在脂質代謝紊亂現象，推測阿昔莫司可能通過改善脂質水平，緩解膿毒癥大鼠心肌損傷。本研究發現，模型大鼠阿昔莫司干預治療后，心肌損傷及心肌細胞凋亡緩解，心肌組織氧化應激產物及炎癥因子釋放減少，證實阿昔莫司或可用于膿毒癥心肌氧化應激、炎癥、血脂水平異常的治療。

細菌、ROS 及炎癥因子等應激刺激條件下，均可促進Nrf2 與Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白Keap1解離并活化轉錄入核，啟動下游HO-1 轉錄，誘導CAT、SOD2 等抗氧化物酶活性增加，而清除ROS積累并發揮抗氧化作用[18]。另外，NF-κB 通路中NF-κB 磷酸化入核活化與炎癥的發生密切相關，其可促進炎癥發展，同時引起機體氧化應激異常，而機體對炎癥和氧化應激的調節可通過Nrf2 通路活化實現，活化的Nrf2 可促進抗氧化酶HO-1 表達，而HO-1 參與調控促炎因子產生，HO-1 表達增加可阻斷NF-κB 磷酸化活化，從而發揮抗炎、抗氧化應激作用，抑制細胞損傷和凋亡[19-20]。Tao 等[21]及Li 等[22]發現，Nrf2/HO-1 通路活化緩解肝組織氧化應激損傷的同時，還能上調脂肪酸激活的轉錄因子PPARα，啟動脂肪酸代謝相關基因SR-A 表達來抑制脂肪酸及TG 等引起的脂質堆積，維持脂質代謝穩態，發揮組織保護作用，預示Nrf2/HO-1 通路激活，也可改善組織脂質代謝異常，發揮抗組織損傷作用。本研究表明，脂多糖可能通過調控Nrf2/HO-1/NF-κB 通路誘導心肌組織氧化應激、炎癥反應和脂質代謝異常，而此時Nrf2、HO-1、SOD2、CAT、SR-A、PPARα 表達增加可能是體內應對氧化應激、炎癥和脂質代謝異常刺激的一種代償反應。進一步分析發現，阿昔莫司作用于膿毒癥大鼠后，心肌組織中Nrf2/HO-1 通路進一步活化，提示阿昔莫司發揮抗膿毒癥心肌氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、血脂水平異常的作用，可能與激活Nrf2/HO-1 通路有關。而用Nrf2 通路抑制劑ATRA 阻斷心肌組織中Nrf2 入核活化后，膿毒癥大鼠心肌組織中HO-1 表達降低，其下游抗氧化應激相關指標SOD2、CAT表達及脂質代謝相關指標PPARα、SR-A 表達亦降低，而NF-κB 磷酸化水平升高，大鼠心肌組織損傷及細胞凋亡進一步加重，炎癥因子、氧化應激產物分泌增加，血脂水平及脂質代謝異常也進一步加重，大鼠死亡增加，提示阻斷Nrf2/HO-1 通路活化，可加重膿毒癥大鼠心肌氧化應激、炎癥、血脂水平異常等反應，從而加劇病情的發展。此外，本研究發現，阿昔莫司+ATRA 組對膿毒癥大鼠的作用效果介于ATRA 組和阿昔莫司組之間，說明ATRA 一定程度上抵消了阿昔莫司對膿毒癥大鼠的作用，這也恰好證明了阿昔莫司發揮抗氧化應激、抗炎、抗凋亡和改善血脂水平異常，從而緩解脂多糖誘導膿毒癥大鼠心肌損傷的作用是通過激活Nrf2/HO-1 通路實現的。但本研究結果與Jia 等[23]研究發現的巨噬細胞中HO-1 的功能喪失可保護脂多糖誘導的心肌損傷結果貌似矛盾，原因可能是：HO-1 在不同細胞中發揮的功能可能略有差別，而本研究檢測的是整個心肌組織中HO-1 表達，而在脂多糖誘導的膿毒癥心肌損傷中，心肌組織中的多種細胞共同參與。

綜上所述，阿昔莫司能激活Nrf2/HO-1 通路介導的抗炎、抗氧化應激及抗脂質代謝異常等途徑，緩解脂多糖誘導建立的膿毒癥大鼠心肌氧化應激、炎癥、脂質堆積等引起的損傷。這可能為阿昔莫司在膿毒癥領域的應用提供一定參考。但膿毒癥心肌損傷機制復雜，還涉及心血管內皮細胞損傷、自噬等，膿毒癥脂質代謝途徑涉及的通路也相對復雜，阿昔莫司在膿毒癥領域的應用，還需進一步探究及驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突