基于Heracles超快速氣相電子鼻對不同產地西洋參快速鑒別研究

查圣華，王俊亮，周舒揚，姜水紅，張 宏

（北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司研發(fā)中心，北京 100085）

西洋參（Panax quinquefoliumL.）為五加科人參屬多年生草本植物，又稱花旗參，洋參等，其性涼，味甘、微苦，其干燥根具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效[1-2]。中醫(yī)傳統認為西洋參的道地產區(qū)為美國威斯康辛州和加拿大，而我國為引種栽培區(qū)，如今東北、山東成為了國產西洋參的主產區(qū)[3-4]，因不同產地西洋參藥材的品質、質量及價格具有較大的差異，市場上常出現以國產西洋參冒充進口西洋參的現象，因此對不同產地西洋參進行快速溯源具有十分重要的意義。

對于中藥材的產地溯源研究主要有形態(tài)學差異法、理化判別法、色譜法、光譜法、生物效應識別技術、質譜識別技術、電子鼻技術和DNA分子標記技術等[5]。目前，對于不同產地西洋參鑒別研究，主要有形態(tài)學差異法、紅外光譜法、理化判別法、高效液相色譜法等[6-8]，但這些方法存在耗時長，主觀性強等缺點。西洋參中主要含有皂苷類、黃酮類、甾醇類、多糖、蛋白質、脂肪酸、核酸、揮發(fā)油、維生素、礦物質以及微量元素等化學成分[9-10]，其中西洋參中人參皂苷是生理活性最顯著的物質，具有抗腫瘤、抗癌、降血壓、降血脂、抗疲勞等多方面的藥理活性[4]。因此對西洋參中人參皂苷基于液相色譜方法鑒別研究較多，研究表明，不同產地，不同批次西洋參中人參皂苷含量差異較大，同一產地，不同批次西洋參中人參皂苷含量差異也較大 ，部分批次國產西洋參中人參皂苷含量甚至遠高于進口西洋參中人參皂苷含量[9-11]，不同產地西洋參中人參皂苷含量不具有顯著產地特征。因此，尋找一種新的，不同產地西洋參快速、有效鑒別方法具有重要意義。

Heracles超快速氣相電子鼻是基于氣相色譜原理的一種氣味分析技術，不同于傳統基于傳感器原理的電子鼻，Heracles超快速氣相電子鼻配有弱極性與中極性的雙色譜柱，雙FID檢測器，可以分離出更多的化合物信號，將篩選的色譜峰作為傳感器，通過化學計量學得到主成分分析，判別因子分析等，建立各種模型實現對氣味物質的判別分析，同時，結合正構烷烴進行校準，將保留時間換算成保留指數，通過AroChemBase 數據庫進行定性分析[12]，具有處理速度快、簡單、成本低等優(yōu)點[13-14]。基于氣相色譜原理的超快速氣相電子鼻已廣泛應用于食品領域，如牛奶[12]、白酒[15]、花椒油[16]、水果蔬菜[17-18]、水產品[19]等的氣味分析。近年來，已有部分學者將超快速氣相電子鼻技術成功運用于中藥材基原鑒別[20-21]、氣味物質基礎研究[22-23]、硫熏鑒別[24-25]以及中藥炮制[26-28]過程中的氣味變化等中藥研究領域，該技術在中藥領域的引入使中藥飲片氣味判別客觀化成為可能[29-30]。基于傳統傳感器原理的電子鼻有用于西洋參氣味的研究，但未見基于超快速氣相電子鼻技術應用于西洋參氣味的研究[31]；司雨等[32]采用HSSPME/GC-MS對國內外西洋參揮發(fā)性成分進行了比較研究，發(fā)現不同產地西洋參中揮發(fā)性成分差異較大，但未能分析不同產地西洋參中揮發(fā)性化合物特性以及揮發(fā)性化合物對西洋參氣味的貢獻，也未能給出不同產地西洋參鑒別模型，因此不能直接鑒定不同產地西洋參。

為了解決上述問題，本研究擬利用Heracles超快速氣相電子鼻，根據氣相色譜峰分離度及區(qū)別強的色譜峰，篩選不同產地西洋參中主要氣味差異化合物，并對主要差異化合物的相對氣味活度值（ROAV）進行分析，并建立其主成分分析（PCA）、判別因子分析（DFA）化學計量模型，從而實現不同產地西洋參快速鑒別分析，為不同產地西洋參進行快速溯源鑒定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參 北京同仁堂藥店，同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司CNAS實驗室研究員按照中國藥典方法鑒定均為五加科植物西洋參的干燥根，西洋參具體樣品信息如下表1；nC6～nC16正構烷烴混合標準品11種正構烷烴在混合標準品中濃度為0.02%～53.27%，美國RESTEK公司；水 為超純水。

表 1 西洋參樣品信息Table 1 Sample information of American ginseng

Heracles NEO 300-G超快速氣相電子鼻 配有Arochembase數據庫、AlphaSoft Version 2021數據處理軟件，法國Alpha Mos公司；CPA225D電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋參樣品制備 將不同產地西洋參片，粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 Heraclese參數設置及實驗條件 Heracles超快速氣相色譜電子鼻系統采用MXT-5弱極性色譜柱與MXT-1701中極性色譜柱同時分析，譜圖同時呈現兩根色譜柱的分離結果[11]。為使樣品具有良好的分析效果，得到較好的色譜信息，本研究固定稱樣量為1.0 g樣品條件下，分別對樣品的加熱振蕩時間、加熱振蕩溫度以及進樣體積進行了單因素考察，根據樣品分離效果及色譜峰響應值，選取加熱振蕩時間為20 min，加熱振蕩溫度為60 ℃，進樣體積為5 mL作為單因素實驗結果，具體分析參數如表2所示。

1.2.3 樣品的測定分析 樣品在Heracles超快速氣相色譜電子鼻上進行測定分析，每個樣品做3個平行樣，準確吸取1.0 g西洋參樣品于20 mL的電子鼻專用頂空瓶中，使用PTFE隔墊密封，將準備好的樣品置于自動進樣器裝置上，待分析。

1.2.4 揮發(fā)性化合物ROAV分析方法 參考劉登勇等[33]提出的相對氣味活度值法（ROAV）分析不同產地西洋參中主要差異化合物對西洋參氣味貢獻大小，首先定義對西洋參樣品整體氣味貢獻最大的物質：ROAVs=100，則對其他揮發(fā)性化合物ROAV計算公式如下：ROAVi≈100×（C%i/C%s）×（Ts/Ti），式中：C%i和Ti分別為各揮發(fā)性化合物的相對百分含量和嗅覺閾值；C%s和Ts分別為對樣品整體風味貢獻最大揮發(fā)性化合物的相對百分含量和嗅覺閾值。按上式計算，所有組分的ROAV≤100，本方法認為1≤ROAV≤100的化合物為關鍵風味化合物，0.1≤ROAV＜1的化合物對樣品的總體風味具有重要的修飾作用。

1.3 數據處理

使用Heracles電子鼻自帶的AlphaSoft V2021數據處理軟件進行主成分分析（PCA）和判別因子分析（DFA），其作圖分析的點為取3個平行樣的平均值作圖。采用正構烷烴標準溶液（nC6～nC16）進行校準，運用AlphaSoft V2021數據處理軟件，根據保留指數計算公式（RIRT=100Z+100[RTR（x）-RTR（z）]/[RTR（z+1）-RTR（z）]，式中：RTR（x）、RTR（z）、RTR（z+1）分別代表目標化合物X及碳數為Z，Z+1正構烷烴的保留時間；Z和Z+1分別為目標化合物X流出前后的正構烷烴所含碳原子的數目。自動將色譜峰保留時間轉化為保留指數（RI）。然后利用保留指數，通過AroChemBase數據庫對主要差異氣味化合物進行定性分析；指紋圖譜運用Origin 2018分析作圖。

表 2 Heraclese分析參數Table 2 Analysis parameters of Heraclese

2 結果與分析

2.1 西洋參氣味指紋圖譜

按照1.2.2實驗條件及1.2.3實驗方法，通過Heracles超快速氣相電子鼻對不同產地西洋參樣品進行檢測分析，共得到12個批次西洋參氣相色譜圖，將圖譜信息導入Origin 2018函數繪圖軟件中獲得2根不同極性色譜柱MXT-5（低極性）和MXT-1701（中極性）的氣味指紋圖譜，結果見圖1。

由圖1西洋參氣味指紋圖譜可以看出，不同產地西洋參色譜信息有明顯差異，為快速篩選出樣品中含量差異較大且對風味貢獻程度大的成分，可利用PCA統計找出樣品組間氣味差異所在，確定差異性色譜峰，再通過Arochembase數據庫進行物質定性找出差異揮發(fā)性氣味物質。

2.2 主成分分析（PCA）

PCA 是一種多元統計方法，可以將采集的多指標進行數據轉換和降維，并對降維的特征向量進行線性分類，捕捉整個數據集間的最大差異，呈現兩維圖或三維圖。PCA分析可以在沒有任何樣品信息的條件下，迅速瀏覽所有數據，找出它們之間的相關性，建立一個合理的模型[34]。在經過超快速氣相電子鼻檢測得到不同批次西洋參樣品的色譜峰面積以及峰數量后，篩選色譜峰區(qū)分能力≥0.900，峰面積≥200，分離效果較好的色譜峰作為傳感器，即為主要成分，進行PCA分析，若樣品的揮發(fā)組分及含量相似度越高，則在PCA上會處于較為接近的位置，差異的大小可以從不同樣品間的距離大小衡量。

由圖2可知，主成分1與主成分2貢獻率之和達到91.389%，因此主成分1與主成分2可以很好地代表樣品的實際情況。同時，識別指數（discrimination index，DI）是用來表征樣品之間區(qū)分度大小的一種判斷方法[35-36]。DI值的有效區(qū)間是80至100，且數值越大則表明數據的效果越佳[37-38]。本研究中識別指數為88，因此不同產地西洋參區(qū)分為有效區(qū)分，且區(qū)分效果較好。如表3所示，美國產西洋參與吉林產西洋參距離最大，說明其美國產西洋參與吉林產西洋參氣味差異較大；美國產品西洋參與加拿大產西洋參距離最小說明其氣味比較接近。因此建立的PCA模型能區(qū)分不同產地西洋參。

圖 1 西洋參氣味指紋圖譜Fig.1 Odor chromatogram of Heracles of American ginseng

圖 2 西洋參PCA分析Fig.2 PCA analysis of American ginseng

2.3 主要差異化合物定性及含量對比分析

在PCA分析的基礎上，利用Arochembase數據庫對篩選的主要化合物進行定性分析。表4中列出了主要差異化合物在MXT-5和MXT-1701兩根色譜柱條件下，按照出峰時間排序后將出峰時間轉化的保留指數，利用Arochembase數據庫進行檢索，確定了主要差異化合物名稱、化合物氣味描述及揮發(fā)性化合物含量，由于儀器的檢測器是氫離子火焰檢測器，為質量型檢測器，物質含量的高低則表現在峰面積大小上，因此通過峰面積大小對樣品含量進行分析[12]。

由表4可知，從不同產地西洋參中篩選出醛、酯、酮、醇、吡嗪、烷烴六個類別，共計13種揮發(fā)性化合物，包括4種醛類化合物，丙醛、正戊醛、正己醛、十二醛；3種酯類化合物，甲酸甲酯、丁酸甲酯、辛酸正丁酯；2種酮類化合物，丙酮、異丙酮；1種醇類化合物，2-庚醇；1種吡嗪類化合物，2,3,5-三甲基吡嗪和2種烷烴化合物，1-苯基辛烷、5-甲基十五烷。13種主要差異揮發(fā)性化合物在不同產地西洋參樣品中均含有，但其含量差異明顯。其中丙酮、正戊醛、正己醛、2-庚醇、2,3,5-三甲基吡嗪、辛酸正丁酯、5-甲基十五烷7種氣味化合物在美國產西洋參中含量較高；甲酸甲酯、十二醛、1-苯基辛烷3種氣味化合物在吉林產西洋參中含量較高；丙醛、異丙酮、丁酸甲酯3種氣味化合物在加拿大產西洋參中含量較高。通過PCA分析篩選出的13種主要差異化合物在不同產地西洋參中含量差異明顯，由于不同揮發(fā)性香氣的香味閾值差異很大，對人體感官的嗅覺刺激差別也很大，揮發(fā)性風味化合物對食品風味的貢獻是由物質的濃度與感覺閾值共同決定的[39]，因此篩選的主要揮發(fā)性化合物對西洋參氣味的影響，不僅與揮發(fā)性化合物含量有關，還與揮發(fā)性化合物的嗅覺閾值有關，因此需要根據相對氣味活度值（ROAV）對篩選的主要差異化合物進行分析，從而確定主要差異化合物對西洋參氣味的貢獻程度大小。

表 3 樣品間的距離Table 3 Distance between samples

2.4 主要差異化合物ROAV分析

為確定關鍵風味化合物對西洋參氣味的貢獻程度大小，按照1.2.4方法對篩選的主要差異化合物進行ROAV分析，化合物的相對含量為面積歸一法計算得到，嗅覺閾值為Arochembase數據庫中對檢索確定化合物嗅覺閾值的說明。13種主要差異化合物中，正己醛相對含量最高，而嗅覺閾值較低，因此定義正己醛ROAV為100，其它主要差異化合物ROAV分析結果如下表5。

表 4 主要差異化合物定性分析Table 4 Qualitative analysis of major differential compounds

參考劉登勇等[33]提出的ROAV分析方法，本方法認為1≤ROAV≤100的化合物為西洋參關鍵風味化合物，0.1≤ROAV＜1的化合物對西洋參樣品的總體風味具有重要的修飾作用。如表5所示，ROAV≥1的關鍵風味化合物有7種，由大到小分別為：正己醛、丙醛、十二醛、正戊醛、2,3,5-三甲基吡嗪、丁酸甲酯和2-庚醇；0.1≤ROAV＜1的化合物有1種為辛酸正丁酯，對西洋參風味有重要修飾作用。結合表4中對西洋參風味起關鍵作用的7種化合物的風味描述可知，西洋參的主要風味為新割青草的氣味、本草植物氣味、辛辣味、甜味、堅果味、油膩的味道。參照《中國藥典》2020版[1]中對西洋參的性味描述為甘、微苦、涼，因此西洋參的甜味描述與《中國藥典》2020版中對西洋參描述一致，而新割青草的氣味、本草植物氣味、辛辣味則是西洋參公認能夠感知到的風味，因此通過ROAV方法分析的對西洋參風味具有關鍵作用的化合物與西洋參風味一致。由表4對西洋參風味起到關鍵作用的化合物含量分析可知，對西洋參風味起到關鍵作用的7種化合物中，ROAV最大的化合物正己醛，其在美國產西洋參中含量最高，在加拿大產西洋參中的含量次之，在吉林產西洋參中含量最低；正戊醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2-庚醇3種化合物在美國產西洋參中含量最高；丙醛、丁酸甲酯在加拿大產西洋參中含量最高；十二醛在吉林產西洋參中含量最高；對西洋參氣味有修飾作用的辛酸正丁酯在美國產西洋參中含量最高。因此，對西洋參氣味貢獻程度較大的7種主要化合物和對西洋參風味有修飾作用的化合物含量高低差異是區(qū)分不同產地西洋參的關鍵指標。由于對西洋參氣味貢獻程度較大的化合物在不同產地中含量各有側重，因此，結合篩選的主要差異化合物，在PCA模型的基礎上，需要進一步縮小組內差異，建立其DFA模型，實現直接對不同產地西洋參進行快速、有效鑒別分析。

表 5 主要差異化合物ROAV分析Table 5 Analysis of ROAV of main difference compounds

2.5 判別因子分析（DFA）

DFA法是一種判定個體所屬類別的統計方法，它在PCA的基礎上，使不同類組群數據間差異盡可能擴大，而使同類組群數據間差異盡可能縮小，從而建立更好識別的數據模型，更好地體現樣品的差異性[40]。利用這些恒定存在的組間差異鑒定未知樣本進行歸類，常用應用包含原產地溯源，原材料鑒別等。

不同產地西洋參判別因子分析如圖5所示，由圖可知，判別因子1判別指數為73.943%，判別因子2判別指數為26.057%，二者之和為100%，說明DFA分析法相對PCA能夠更好地區(qū)分不同產地西洋參的差異。利用AlphaSoft Version 2021多元統計中DFA分析，投影未知樣品色譜信息，并對投影結果進行判定未知樣品歸屬。本研究投影未知樣品1、未知樣品2、未知樣品3圖譜信息到建立的DFA模型，投影結果如圖5中所示，對投影結果進行判定，未知樣品1～3分別屬于AM組、JL組、CA組，識別值分別為97.2%、100%、100%，說明DFA對未知樣品判別能力較高。因此使用建立的DFA模型，可以對不同產地西洋參進行快速鑒定。

圖 5 判別因子分析圖Fig.5 The graph of discriminant factor analysis

3 結論

本研究采用Heracles超快速氣相電子鼻技術從不同產地西洋參中篩選出丙醛、正戊醛、正己醛等13種主要差異化合物，通過對主要差異化合物的ROAV分析，正己醛、丙醛、十二醛、正戊醛、2,3,5-三甲基吡嗪、丁酸甲酯、2-庚醇 7個主要差異化合物ROAV≥1，因此是對西洋參風味起到關鍵作用的化合物，對西洋參氣味貢獻較大，其中正己醛是對西洋參氣味貢獻最大的關鍵氣味化合物。正己醛、正戊醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2-庚醇在美國產西洋參中含量最高；丙醛、丁酸甲酯在加拿大產西洋參中含量最高；十二醛在吉林產西洋參中含量最高。建立了PCA、DFA化學計量模型，PCA 模型的識別指數為88，DFA 模型的判別因子累計區(qū)分指數為100%，說明PCA、DFA 模型均能較好地區(qū)分不同產地西洋參氣味，能夠對西洋參樣品氣味進行快速鑒別分析。因此，本研究通過Heracles超快速氣相電子鼻技術，不僅確定了對西洋參氣味貢獻程度較大的揮發(fā)性氣味化合物，還可以實現不同產地西洋參快速、有效鑒別及產地溯源，與通過人參皂苷鑒別、HS-SPME/GCMS方法鑒別不同產地西洋參揮發(fā)性成分相比，基于Heracles超快速氣相電子鼻對不同產地西洋參快速鑒別的方法更加客觀、高效、便捷、綠色，為西洋參質量控制和產地溯源提供了科學依據。