夏枯草中16種酚類(lèi)化合物含量的測(cè)定及其與抗氧化活性的相關(guān)性分析

羅 敏，何 婷，龔 磊，陳榮祥

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，貴州遵義 563000；4.遵義市理化分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，貴州遵義 563000）

夏枯草（Prunella vulgarisL.）是唇形科夏枯草屬多年生草本植物，廣泛分布于東亞和歐洲，在我國(guó)有悠久的食用和藥用歷史[1-2]。夏枯草的主要藥用和食用部位為其干燥果穗，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗病毒、抗炎、降血壓和抗腫瘤等作用[3-4]，可作為糖尿病的保健食品和藥品[5]，也可用作湯料和涼茶[6]，其花蜜經(jīng)充分釀造后具有很好的抗結(jié)腸炎和調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[7]。夏枯草含有豐富的酚酸、黃酮、三萜酸等化學(xué)成分[2,8]，其中酚類(lèi)化合物是夏枯草重要的活性成分[9]。酚類(lèi)化合物可抵御紫外線(xiàn)或病原菌的侵襲，具有很好的抗氧化活性，可清除自由基對(duì)人體生命造成的損傷[10]，目前已經(jīng)作為天然的抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品方面[11]。夏枯草中的酚類(lèi)化合物主要有迷迭香酸、丹參素、咖啡酸等，在《中國(guó)藥典》2020年版中，迷迭香酸就被作為夏枯草含量測(cè)定的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]。近年的研究也多采用高效液相色譜法測(cè)定酚類(lèi)物質(zhì)的含量，但是所能測(cè)定的指標(biāo)多集中于迷迭香酸、丹參素、咖啡酸等少數(shù)幾種化合物[13-14]。

相對(duì)傳統(tǒng)的液相色譜-紫外檢測(cè)法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）具有分析速度快、分離效能高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于各種復(fù)雜化合物的分析，且測(cè)定低限可達(dá)納克級(jí)[15-17]。如Ozdal等[18]采用LC-MS/MS法研究了土耳其蜂膠提取物中的多酚組成，并鑒定出32種酚類(lèi)化合物；Schulz等[19]采用LC-MS/MS法定量了黃色番石榴果實(shí)酸水解后的23種酚類(lèi)物質(zhì)，不僅具有極高的靈敏度，而且還可提供常規(guī)方法難以獲取的結(jié)構(gòu)信息；羅弘杉等[20]采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜鑒定夏枯草中的酚類(lèi)化合物，具有較高的分辨率，但未對(duì)多組分進(jìn)行定量分析。

在色譜分離的基礎(chǔ)上，將化學(xué)成分和生物活性成分相結(jié)合進(jìn)行相關(guān)性分析，可明確不同成分對(duì)于生物活性的貢獻(xiàn)。灰色關(guān)聯(lián)分析（grey correlation analysis, GRA）和偏最小二乘回歸（partial least squares regression, PLSR）分析是較常用的多因素統(tǒng)計(jì)方法，GRA將因素間發(fā)展的相似性程度作為衡量系統(tǒng)中各因素間的關(guān)聯(lián)程度，即灰色關(guān)聯(lián)度（gray relational degree, GRD），現(xiàn)已被廣泛用于解決多因素、多變量之間復(fù)雜相互關(guān)系的問(wèn)題；PLSR是一種對(duì)主成分分析和多元回歸的特征進(jìn)行泛化和組合的方法，能有效地解決變量間的多重共線(xiàn)性問(wèn)題[17,21]。目前對(duì)于各種食品的品質(zhì)調(diào)控多采用PLSR或GRA進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以此計(jì)算食品品質(zhì)的影響程度，進(jìn)而分析影響因素與綜合評(píng)分的相關(guān)性[22-23]。

因此，本研究采用LC-MS/MS對(duì)夏枯草中16種酚類(lèi)化合物進(jìn)行定量分析，采用DPPH、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power, FRAP）對(duì)夏枯草的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步采用GRA、PLSR法對(duì)24批夏枯草中16種酚類(lèi)化合物的相關(guān)性進(jìn)行分析，以此探討夏枯草抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，為全面提高夏枯草的質(zhì)量控制水平及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏枯草樣本分別采自廣東、河南等9個(gè)省份，其詳細(xì)信息見(jiàn)表1。樣本經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)顧丁副教授鑒定為唇形科植物夏枯草（Prunella vulgarisL）的干燥果穗。

表 1 24批夏枯草樣品信息Table 1 Information of 24 batches of Prunella vulgaris

對(duì)羥基苯甲酸、異槲皮苷、七葉內(nèi)酯 Ark Pharm公司；對(duì)羥基肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸 Adamasbeta公司；迷迭香酸、綠原酸、咖啡酸、3,4-二羥基苯甲酸、金絲桃苷、阿魏酸、水楊酸、蘆丁 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異迷迭香酸苷 成都麥德生科技有限公司；丹參素 辰光生物有限公司；3,4-二羥基苯甲醛 北京伊諾凱科技有限公司；所有對(duì)照品的純度≥97%；乙腈 質(zhì)譜純，霍尼韋爾貿(mào)易有限公司；室驗(yàn)用水 屈臣氏；其余試劑為分析純。

I-class+XevoTQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（配MassLynx V.4.1軟件） 美國(guó)Waters；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技；ME104E電子天平 美國(guó)梅特勒-托利多。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將夏枯草粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品粉末，加40 mL 80%的甲醇在室溫條件下超聲提取30 min，提取完成后將提取液置于-20 ℃條件下靜置1 h，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析和抗氧化能力測(cè)定。

1.2.2 對(duì)照品配制 精密稱(chēng)取16種夏枯草對(duì)照品，分別加入甲醇溶解定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)用80%甲醇將其稀釋成所需的混合對(duì)照品工作溶液。

1.2.3 LC-MS/MS法測(cè)定16種酚類(lèi)化合物

1.2.3.1 液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，采用0.1%甲酸（A）-乙腈（B）作為流動(dòng)相在體積流量為0.4 mL/min下進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～15 min，95%～70% A；15～19.5 min，70%～50% A；19.5～20.5 min，50%～5% A；20.5～21.5 min，5% A；21.5～22 min，5%～95% A；22～25 min，95% A。柱溫為45 ℃；進(jìn)樣器溫度為12 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源在負(fù)離子及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring, MRM）模式下檢測(cè)16種酚類(lèi)化合物，并采用兩組離子對(duì)分別對(duì)16種酚類(lèi)化合物進(jìn)行定量和定性分析，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。毛細(xì)管電壓為3 kV，蒸發(fā)溫度為500 ℃、氣流量為750 L/Hr。

1.2.4 抗氧化活性

1.2.4.1 鐵離子還原能力 取醋酸鹽緩沖溶液（pH3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液加入到600 μL稀釋后的樣品溶液中混勻，暗反應(yīng)30 min后于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度。空白組中樣品溶液的吸光度測(cè)定采用80%的甲醇代替。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y=0.0258X+0.0645和r=0.9997，其中，Y為吸光度（Au），X為T(mén)rolox濃度（mg/L）。所有樣品測(cè)量結(jié)果均以Trolox當(dāng)量表示（mg TE/g DW）。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力 ABTS工作液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取ABTS試劑0.0282 g，用蒸餾水溶解定容至7.5 mL，再加入7.5 mL 2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液，在室溫下避光放置8～12 h后用純水稀釋20倍后備用。取200 μL稀釋100倍后的樣品溶液加入到0.4 mL ABTS工作液中，暗反應(yīng)30 min后于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度。空白組中樣品溶液的吸光度測(cè)定以80%甲醇代替，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y=-0.00901X+0.5311和r=0.9998，其中Y為吸光度（Au），X為T(mén)rolox濃度（mg/L）。所有樣品測(cè)量結(jié)果的表示同“1.2.4.1”項(xiàng)。

1.2.4.3 DPPH自由基清除能力 取200 μL稀釋30倍后的樣品溶液加入到400 μL 0.14 mol/L的DPPH溶液中，混勻，暗反應(yīng)30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度。空白組中樣品溶液的吸光度測(cè)定以及所有樣品測(cè)量結(jié)果的表示同“1.2.4.1”項(xiàng)。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y=-0.0155X+0.8361和r=0.9993。其中Y為吸光度（Au），X為T(mén)rolox濃度（mg/L）。

1.2.5 相關(guān)性分析

1.2.5.1 GRA 以16種酚類(lèi)化合物含量和DPPH、ABTS自由基清除能力和FRAP效應(yīng)值分別作為自變量和因變量。在判別系數(shù)設(shè)為0.5的情況下，計(jì)算GRD值，GRD越高，相應(yīng)的酚類(lèi)化合物抗氧化活性越大。

1.2.5.2 PLSR 采用16種酚類(lèi)化合物的含量作為自變量，DPPH、ABTS和FRAP值作為因變量。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件SIMCA 14.1中進(jìn)行PLSR分析，得出各自的CoeffCS值和VIP值，以分析自變量與因變量的關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Waters公司的MassLynx V4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Origin 2018版以及SIMCA 14.1版軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 夏枯草中16種酚類(lèi)成分質(zhì)譜條件優(yōu)化及LCMS/MS色譜圖

對(duì)16種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行錐孔電壓、碰撞能量等條件的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。標(biāo)準(zhǔn)品圖見(jiàn)圖1A，除丹參素、迷迭香酸和異迷迭香酸苷濃度為5 mg/L外，其余化合物濃度均為0.5 mg/L。夏枯草樣品圖見(jiàn)圖1B。

圖 1 混合對(duì)照品（A）和樣品（B）提取離子流色譜圖Fig.1 The extract ion chromatograms of mixed reference (A)and testing sample (B)

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系 分別精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液配制成不同濃度的混標(biāo)，按“1.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄測(cè)定后16種酚類(lèi)化合物的峰面積。以對(duì)照品的濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，各待測(cè)成分色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果顯示，16種酚類(lèi)成分在各自的線(xiàn)性范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好（r＞0.99）。檢出限（S/N=3）在2.80～9.47 ng/mL之間，其回歸方程以及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表 2 16種主要成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and mass parameters of the 16 components

2.2.2 重復(fù)性 稱(chēng)取編號(hào)為S14的夏枯草粉末約1 g，按“1.2.1 樣品制備”方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜和質(zhì)譜條件，測(cè)定并記錄夏枯草中16種化合物的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值≤5.71%。

2.2.3 精密度 精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液并將其配制成0.5 mg/L的工作液（其中，異迷迭香酸苷、丹參素和迷迭香酸濃度為5 mg/L），按上述質(zhì)譜和色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量1 μL，測(cè)定并記錄16種化合物的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值≤2.24%。

2.2.4 穩(wěn)定性 稱(chēng)取編號(hào)為S14的夏枯草粉末約1 g，按“1.2.1 樣品制備”方法制備供試品溶液，按上述測(cè)試條件在24 h（0、4、8 、12、16、24 h）內(nèi)測(cè)定16種化合物的穩(wěn)定性，記錄夏枯草中16種化合物的峰面積變化并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示24 h內(nèi)RSD值≤5.06%。

2.2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取同一批含量已知的夏枯草（S6）粉末3份，每份約1 g，按照含量1:1準(zhǔn)確加入16種化合物，按“1.2.1 樣品制備”方法制備供試品溶液，按上述測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)定，考察回收率，平均加標(biāo)回收率在95.31%～103.74%之間，其RSD值≤6.24%。方法學(xué)考察結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 樣品含量測(cè)定

分別稱(chēng)取夏枯草樣品粉末，按“1.2.1 樣品制備”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，按上述測(cè)試條件測(cè)定夏枯草中16種酚類(lèi)化合物并記錄各種化合物的峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

24批樣品中化合物的含量差異很大。其中，迷迭香酸、異迷迭香酸苷含量最高，丹參素次之，其含量分別為205.97～1036.73 mg/100 g、44.73～120.67 mg/100 g和16.24～59.24 mg/100 g。劉月新等[24]的研究表明，夏枯草在不同生長(zhǎng)階段其化學(xué)成分含量不同，迷迭香酸和異迷迭香酸苷在枯萎期含量明顯增加。劉光敏等[25]的研究指出同一品種夏枯草藥材因產(chǎn)地不同其酚類(lèi)成分含量也有較大差異。因此，樣品間的差異不僅與產(chǎn)地有關(guān)，而且受采收時(shí)間影響。

2.4 抗氧化活性研究

DPPH、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力結(jié)果見(jiàn)表5。在24批夏枯草樣品中，DPPH、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力的范圍分別為7.53～43.83 mg TE/g DW、10.75～34.93 mg TE/g DW和8.53～47.76 mg TE/g DW。其中，抗氧化能力最好的夏枯草樣品為S6，較差的樣品為S7和S24。

2.5 夏枯草中16種酚類(lèi)化合物與抗氧化能力的關(guān)聯(lián)性分析

2.5.1 GRA分析 利用GRA分析夏枯草中16種酚類(lèi)化合物含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，以評(píng)價(jià)這些成分的活性貢獻(xiàn)。GRD值用來(lái)描述成分與抗氧化活性之間的關(guān)系，GRD大于0.6說(shuō)明化合物與抗氧化活性之間具有相關(guān)性，GRD大于等于0.8說(shuō)明相關(guān)性較強(qiáng)[26-27]。16種酚類(lèi)化合物與抗氧化活性相關(guān)性的GRD值如表6所示，16種化合物的GRD值均大于0.6，可見(jiàn)這些化合物均和抗氧化活性相關(guān)。其中，迷迭香酸與DPPH、ABTS、FRAP的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，蘆丁和DPPH的關(guān)聯(lián)度大于0.8，咖啡酸、蘆丁和FRAP的關(guān)聯(lián)度大于0.8，它們具有相對(duì)較高的GRD值可以認(rèn)為是夏枯草中關(guān)鍵的抗氧化成分。

表 3 方法學(xué)考察Table 3 Method validation of the proposed method

表 4 24批夏枯草樣品中16種酚類(lèi)化合物含量測(cè)定結(jié)果（mg/100 g）Table 4 The contents of 16 phenolic compounds in 24 batches of Prunella vulgaris (mg/100 g)

2.5.2 PLSR分析 采用PLSR分析DPPH、ABTS、FRAP法與夏枯草中16種酚類(lèi)化合物的相關(guān)性，以16種酚類(lèi)化合物含量為X變量，以DPPH、ABTS、FRAP值為Y變量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。CoeffCS系數(shù)的正負(fù)表示不同化合物同抗氧化活性正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，VIP值代表相關(guān)性強(qiáng)弱。從結(jié)果可以看出，對(duì)3種抗氧化活性均呈正相關(guān)且VIP值大于1.0的化合物有迷迭香酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、咖啡酸、水楊酸、2,5-二羥基苯甲酸。

圖 2 16種化合物的偏最小二乘回歸相關(guān)性分析CoeffCS （A）和VIP （B）圖Fig.2 Correlation coeffCS (A) and VIP (B) values of the 16 compounds analyzed by PLSR

大量研究表明，酚類(lèi)化合物是食用/藥用植物抗氧化的主要來(lái)源[28-29]。本研究結(jié)合GRA與PLSR相關(guān)性分析可知，夏枯草中16種酚類(lèi)化合物均具有抗氧化活性，GRD值均大于0.6，且GRA與PLSR相關(guān)性分析均表明迷迭香酸抗氧化能力最好。

表 5 24批夏枯草抗氧化能力結(jié)果Table 5 The antioxidant capacity in 24 batches of Prunella vulgaris

表 6 GRA結(jié)果Table 6 The results of GRA

3 結(jié)論

綜上所述，本研究成功運(yùn)用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定夏枯草中16種酚類(lèi)化合物的含量，該方法線(xiàn)性關(guān)系良好（r＞0.99），靈敏度較高。24批夏枯草中不同酚類(lèi)化合物含量在0.02～1036.73 mg/100 g之間，其中，迷迭香酸含量最高，為205.97～1036.73 mg/100 g。進(jìn)一步采用GRA和PLSR分析了化學(xué)成分與DPPH、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力的相關(guān)性。GRA結(jié)果表明16種酚類(lèi)化合物與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.6，均與抗氧化活性相關(guān)。PLSR的結(jié)果表明迷迭香酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、咖啡酸等化合物對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)較大。本研究不僅測(cè)定了夏枯草中主要化合物的含量，而且明確了主要化學(xué)成分對(duì)抗氧化的貢獻(xiàn)，可為夏枯草質(zhì)量控制與開(kāi)發(fā)利用提供參考。