m6ARNA甲基化在骨發育中的研究進展

崔帥帥 綜述 楊曉紅 審校(遵義醫科大學附屬口腔醫院，貴州 遵義 563000)

骨穩態取決于成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨破壞的平衡。BMSCs是一種異質性的干細胞，可以從許多不同來源獲得，并分化為中胚層類型譜系，包括成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞[1]。BMSCs廣泛應用于干細胞移植、基因治療、組織工程和免疫治療等領域[2]。BMSCs通常從骨髓抽吸物中分離并表征其特征，無論是科學研究，還是臨床目的，BMSCs都被認為是最有希望的骨再生細胞來源[3]。BMSCs具有向成骨譜系分化的高親和力，其向成骨細胞分化是骨再生和修復過程中的關鍵步驟[4]，但同時BMSCs也有向脂肪細胞、軟骨細胞分化等潛能。在衰老或其他病理刺激下，如激素紊亂等，BMSCs向脂肪細胞分化增多[5]，導致骨髓環境中脂肪組織過度堆積，骨微結構改變，骨骼脆性增加，骨折風險變大[6]。然而，BMSCs干細胞的譜系分配傾向于成脂或成骨譜系的明確機制尚不清楚。證據表明[7]，BMSCs的成骨分化與多種遺傳因素密切相關，如信號分子、生長因子等，但近年來細胞分化的表觀遺傳調控機制越來越受到關注。最近的研究證據[8]表明，表觀遺傳修飾，如組蛋白乙酰化和DNA甲基化，參與了BMSCs在骨再生過程中的細胞分化過程。N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾作為表觀遺傳調控的另一層(RNA表觀遺傳學)，最近被報道在胚胎干細胞(ESCs)和各種癌細胞類型的細胞功能和分化中發揮重要作用[9]。然而，對于m6A修飾在BMSCs細胞分化中的作用知之甚少。鑒于m6A與健康和疾病的強烈相關性，學者們對于m6A在骨穩態中的潛在作用也做出了重要的探索，本文將對m6A在骨發育過程中的相關研究作一綜述。

1 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾概述

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是最普遍的轉錄后內部mRNA修飾，參與多種生物過程的微調[10]。在哺乳動物中，m6A由甲基轉移酶復合物(MTC)催化，該復合物由一個酶亞基甲基轉移酶樣3(METTL3)和一個底物識別亞基甲基轉移酶樣14(METTL14)和一個調節亞基Wilms腫瘤1相關蛋白(WTAP)等蛋白組成，多種蛋白質共同參與調節MTC的功能，從而使m6A甲基化能夠高效、精準的調控細胞的生物學功能。MTC可以被去甲基酶脂肪與肥胖相關蛋白(FTO)和人類ALKB同系物5(ALKBH5)清除[11]，使m6A修飾成為動態可逆的過程。在分子水平上，m6A標記可以動態安裝和從其被調控的轉錄本中移除，以調節RNA代謝，包括選擇性剪接、RNA穩定性和翻譯[12]。m6A發揮作用的主要機制是通過招募m6A結合蛋白，可以被含有YTH (YT521B同源性)結構域的蛋白識別，也可以被真核起始因子3 (eIF3)識別[13]，進而影響RNA的加工和表達。

2 m6A在成骨分化中的正向調控作用

一項研究[14]通過RNA測序證實，METTL3基因敲除后，大量受影響的基因與成骨分化和骨礦化相關，如Runx2、Osterix、ALP等。METTL3通過調節PI3K-Akt信號通路和VEGF的表達水平影響BMSCs的成骨分化。抑制METTL3可降低BMSCs成骨分化過程中Akt磷酸化、Vegfa及其選擇性剪切的表達水平。G.Yan等[15]利用m6A RNA免疫沉淀(RIP)芯片發現pre-miR-320是BMSCs中METTL3靶基因中m6A甲基化最強烈的基因，在METTL3沉默后其甲基化顯著降低。此外，他們進一步證明了RUNX2是miR-320的靶基因，而METTL3/m6A通過雙重機制上調RUNX2的表達水平來實現成骨：(1) METTL3/m6A通過抑制pre-miR-320和miR-320上調RUNX2水平；(2)METTL3/m6A促進RUNX2 mRNA的直接甲基化，提高其表達水平和細胞穩定性。

3 m6A在成骨分化中的負向調控作用

然而，還有一些不同的聲音。J.Yu等[16]研究發現METTL3正調控MYD88的表達，MYD88是NF-κB的擴散接受調節因子，隨后激活NF-κB信號通路，而NF-κB信號通路被認為是成骨的抑制因子，從而負調控成骨。不過，這種傾向可以被去甲基化酶ALKBH5逆轉。在另一項研究[17]中也證明了METTL3在體外和體內均抑制成骨過程，而這種作用是通過METTL3/ mir-712-5p/FGFR3軸實現的。具體來說，METTL3介導了miR-7212-5p水平的升高，miR-7212-5p通過靶向FGFR3抑制MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化。此外，H.E.Son等[18]也首次證實了FTO通過誘導輕度內質網應激激活成骨分化的潛在機制，在C3H10T1/2細胞中，p-AMPK上調FTO的表達，FTO誘導AMPK磷酸化，FTO與p-AMPK之間存在正反饋回路；在機制上，m6A去甲基化酶FTO調控內質網應激基因啟動子的去甲基化，從而刺激內質網應激，進而促進成骨分化。

4 m6A在成軟骨分化中的作用

在原代軟骨細胞單層培養中，軟骨細胞發生脫分化，失去表型和形成軟骨的能力。基于微陣列分析，B. Ma等[19]發現體外擴增的人類軟骨細胞檢測到總基因表達總體下降。DNA甲基化部分導致許多基因的表達下調。通過整合RNA-Seq和ERRBS數據集，軟骨細胞肥大分化還伴隨著體外DNA甲基化的變化。此外，在炎癥條件下，在IL -1b處理的ATDC5細胞中METTL3 mRNA和m6A甲基化水平呈劑量依賴的方式上調。有趣的是，只有MELLT3的表達量增加，而其他調控因子的表達量未受顯著影響。當METTL3沉默時，ECM通過降低MMP-13和Coll X的表達，上調Aggrecan和Coll II的表達來加速降解。這表明METLL3在介導炎性因子分泌、軟骨細胞膠原合成和降解方面具有重要意義，并且有可能是骨關節炎的治療靶點[20]。

5 m6A在成脂分化中的作用

就像“骨質流失就是脂肪增加”的觀點一樣，成骨的反義詞是脂肪形成[21]。FTO是一種與人類肥胖有關的基因，它通過控制m6A水平和mRNA剪接來調控脂肪生成。X.Zhao等[22]證明m6A位點與SRSF1-和2-結合簇存在空間重疊，因此m6A修飾可以被視為一種新的外顯子RNA剪接順式調控信號。FTO通過調控m6A水平，從而控制SRSF2在剪接位點的結合，調節前脂肪細胞分化的RUNX1T1的選擇性剪接。miRNA在調控BMSCs分化為特定譜系方面有很大的作用。MiR-149-3p通過直接靶向FTO調控BMSCs分化為脂肪細胞和成骨細胞的交替譜系，其在BMSCs中表達在成脂肪分化過程中降低，而在成骨分化過程中增加[23]。FTO可以通過調控下游信號通路m6A水平促進成脂分化。METTL3-YTHDF2介導的m6A甲基化通過靶向JAK1/STAT5/C/EBPβ通路抑制豬BMSCs脂肪形成過程[24]。FTO也能通過GDF11-FTO-PPAR軸調控BMSCs的命運，抑制成骨過程，促進BMSCs譜系向脂肪細胞轉移[25]。

6 m6A在破骨細胞分化中的作用

破骨細胞是來源于造血前體細胞的大型多核細胞[26]。破骨細胞作為唯一的骨吸收細胞，在維持骨穩態和保持骨骼完整方面起著至關重要的作用。Lorenzo de la Rica等通過轉錄因子結合基序分析發現，在破骨細胞分化和融合過程中，關鍵功能通路和基因發生低甲基化和高甲基化[27]。破骨細胞誘導后m6A和METTL3的總表達增加，但FTO和ALKBH5的表達不增加。當Mettl3被敲除時，破骨細胞的大小增加，但骨吸收能力降低。從機制上講，Mettl3抑制破骨細胞基因(Nfatc1、cFos、Ctsk、Acp5和Dcstamp)的表達，并失活RANKL誘導的MAPK、NF-κB和PI3K-AKT信號通路的磷酸化水平。相反，Atp6v0d2的表達增加，這是一個促進細胞-細胞融合和多核過程的融合相關基因，由于Mettl3和YTHDF2的缺失提高了Atp6v0d2 mRNA的穩定性[28]。這些發現闡明了RNA表觀遺傳調控破骨細胞發育的分子基礎。

7 小結和展望

基因表達在轉錄、轉錄后、翻譯和翻譯后等不同層面受到密切控制。在BMSCs的一些轉錄本上發現了m6A甲基化，特別是那些編碼發育調節因子的轉錄本，這些調節因子調控BMSCs分化為特定的譜系。m6A修飾與調控成脂分化的下游信號通路如PTH/PTH1r通路、PI3K/AKT通路、wnt/β-catenin通路等存在交叉，拓寬了干細胞分化的多層調控。另一方面，m6A調控因子(“編寫器”、“擦除者”和“讀取者”)也被ncRNA調控，例如miRNA 320、miRNA 149-3p和miRNA7212-5p，這些上游miRNA可能也是后續研究中有趣的候選miRNA。這種表觀遺傳機制可以決定BMSCs的命運，并為干細胞生物學中轉錄后水平基因調控網絡提供了新的視角。然而BMSCs的臨床應用效率有限，因為有可能分化成不需要的組織。因此，要成功利用BMSCs通過m6A調控產生中胚層譜系來治療骨病，了解其分化為特定終末譜系的分子機制至關重要，這將是未來的研究重點。