DTP3治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤研究進(jìn)展

田珂凡

510006廣東藥科大學(xué)，廣東廣州

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)

DLBCL 是一種常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占NHL 的24%[1]。與其他類型的B 細(xì)胞淋巴瘤相比，DLBCL 具有高侵襲性，表現(xiàn)為疾病的快速進(jìn)展。只有50%的患者通過使用包括利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松等混合藥物的標(biāo)準(zhǔn)治療獲得完全緩解，而另外50%的患者預(yù)后普遍較差[2]。DLBCL 可進(jìn)一步分為活化B 細(xì)胞(ABC)樣亞型、生發(fā)中心B 細(xì)胞(GCB)樣亞型和基于來源細(xì)胞未分類的亞型[3]。已知有許多致癌基因與這些疾病相關(guān)，如c-myc、bcl-2、bcl-6、EZH2、MYD88、CREBBP、CD79A和CD79B，以及PAX5[2]。

構(gòu)成型IκB磷酸化激酶β(IKKβ)/核因子-κB(NF-κB)激活在DLBCL中的作用

NF-κB 通路的抗凋亡作用于1995年首次在肝臟中發(fā)現(xiàn)，RelA 敲除小鼠在胚胎形成過程中表現(xiàn)出大規(guī)模的肝細(xì)胞凋亡[4]，所以其在免疫系統(tǒng)中的主要作用，特別是在B 細(xì)胞生存和成熟中的必要性也被發(fā)現(xiàn)[5]。活化的NF-κB 復(fù)合物由RelA 和p50 組成，是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過抵抗自然凋亡來調(diào)節(jié)基因，這些基因是正常細(xì)胞存活的關(guān)鍵，其激活了許多抵抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)信號引起的細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，包括cIAP、cIAP2、XIAP、TRAF1、TRAF2、c-FLIP 和bcl-2成員[6]。此外，還具有直接和間接抑制JNK通路的作用，通過上調(diào)生長抑制和DNA 損傷誘導(dǎo)的Gadd45β蛋白來抑制JNK 通路介導(dǎo)。絲裂酶原活性蛋白激酶7(MKK7)拮抗劑Gadd45β 可以阻止JNK 的磷酸化，從而激活JNK[7]。NF-κB 通路的構(gòu)成型激活與DLBLC的ABC 樣亞型的生存和惡性腫瘤有關(guān)，在ABC 細(xì)胞系中觀察到IκBα蛋白體降解、IκB激酶活性與DNA結(jié)合具有高發(fā)生率。有研究表明，抑制NF-κB通路可導(dǎo)致ABC-DLBLC細(xì)胞系中癌細(xì)胞死亡和在G1處生長阻滯[8]。此外，在漿細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤中也觀察到通過上調(diào)Gadd45β蛋白表達(dá)的特異性JNK抑制[9]。

DLBCL目前的治療方案

淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法(R-CHOP 方案)對于新診斷病例的一線治療，可根據(jù)腫瘤大小和分期進(jìn)行化療。有學(xué)者采用利妥昔單抗替代奧布妥珠單抗和添加劑量調(diào)整的依托泊苷，同時改變劑量和間隔時間，以改善標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP 方案，但治療效果不顯著[10-11]。基于細(xì)胞的起源，ABC亞型被發(fā)現(xiàn)在很大程度上是由B細(xì)胞受體(BCR)信號通路，然后導(dǎo)致NF-κB通路失調(diào)，可能導(dǎo)致失控的細(xì)胞增殖和高抵抗細(xì)胞凋亡、自噬和壞死[12-13]?；谶@一觀察，有學(xué)者在標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP 方案中添加了一種旨在抑制蛋白體降解的激活RelA 和p50復(fù)合物，以特異性靶向BCR和NF-κB通路，然而伊布替尼和硼替佐米在Ⅱ期和Ⅲ期階段均無顯著效果[14]。這表明需要一種新的治療藥物，專門靶向NF-κB通路治療ABC樣亞型，與GCB樣亞型相比，預(yù)后較差。

對于復(fù)制性和難治性疾病，通?？紤]挽救性化療和自體干細(xì)胞移植(ASCT)。然而，使用ASCT 治療的R/R DLCBL 的效果較差，只有37%的患者成功達(dá)到了3年無進(jìn)展生存時間(PFS)，而對于不符合移植條件的患者，則3年P(guān)FS甚至更低。

靶向NF-κB通路在癌癥中的益處和局限性

由于NF-κB 在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在癌癥中靶向NF-κB 通路可能存在需要解決的顯著缺陷。小鼠中IKKβ 缺失導(dǎo)致的NF-κB 抑制時間延長，由于白細(xì)胞介素-1β 水平的升高，導(dǎo)致內(nèi)毒素休克的發(fā)生率更高[15]。此外，NF-κB通路可以被繞過，尤其是在實(shí)體癌癥中，在NF-κB 中觀察到生長抑制，而不是預(yù)期的細(xì)胞凋亡。此外，還有一些方法可以通過激活該通路的其他成分來覆蓋抑制作用，例如，對IKKβ的抑制作用可以被IKKε 所取代。另一方面，靶向NF-κB 的好處已經(jīng)在一些動物模型中得到了證實(shí)。在結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌的小鼠模型中也觀察到癌細(xì)胞凋亡和癌癥進(jìn)展停止的結(jié)果[13]。在血癌的情況下，多發(fā)性骨髓瘤中NF-κB 抑制顯示了對癌細(xì)胞的特異性殺傷，對正常細(xì)胞幾乎無不良反應(yīng)[9]。

Gadd45β靶向藥物在癌癥中的潛力

Gadd45β 基因是NF-κB 復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，編碼的蛋白占據(jù)MKK7 的催化口袋并抑制，MKK7 是負(fù)責(zé)磷酸化的關(guān)鍵激酶，從而激活JNK，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這一機(jī)制發(fā)現(xiàn)被多發(fā)性骨髓瘤劫持，并開發(fā)了一種高效、低毒性的治療藥物DTP3，可特異性逆轉(zhuǎn)Gadd45β 對MKK7 的抑制[9]。該藥物證明了Gadd45β在其他類型癌癥中靶向的潛力，許多對NF-κB 途徑上癮的癌癥之一是DLBCL，這可能也存在Gadd45β抑制。此外，Gadd45β復(fù)合物也在許多實(shí)體癌中被發(fā)現(xiàn)，包括肝細(xì)胞癌和結(jié)腸直腸癌。

理由和目的

NF-κB 在DLBCL 孤雌生殖中的作用已經(jīng)在許多研究中得到證實(shí)，特別是對于更具侵襲性的ABC 亞型。盡管目前使用R-CHOP 方案治療對50%的患者具有顯著治療效果，但另外50%患者需要一種新的高效和安全的治療方法。Gadd45β 是通過NF-κB 復(fù)合物抑制JNK 凋亡通路的上調(diào)基因產(chǎn)物之一。Gadd45β 合成一種名為DT3的三肽，旨在變構(gòu)逆轉(zhuǎn)對MKK7 的抑制，MKK7是激活JNK 的關(guān)鍵激酶。DTP3對多發(fā)性骨髓瘤患者細(xì)胞表現(xiàn)出良好的治療效果，且對其他組織細(xì)胞的毒性較小[9]。這一結(jié)果使學(xué)者們認(rèn)為是否可以在DLBCL患者細(xì)胞中產(chǎn)生類似的結(jié)果，從而更多地闡明其潛在機(jī)制和其他類型NHL的開放可能性。

基于上述簡短的推理，進(jìn)行以下假設(shè)：①Gadd45β在ABC-DLBCL 孤雌生殖中具有重要作用：為了研究Gadd45β 在ABC-DLBCL 腫瘤發(fā)生中的作用，制備Gadd45β 野生型和Gadd45β 敲除(KO)小鼠模型。這兩種小鼠模型都具有高的構(gòu)成性NF-κB 激活來驅(qū)動B細(xì)胞的增殖和分化。在GC-B 細(xì)胞中，通過缺失Blimp1(Blimp1F/F)和cre 介導(dǎo)去除IKK2 上游的STOP序列來實(shí)現(xiàn)NF-κB 通路的靶向特異性激活。如果沒有Blimp1，GC-B 細(xì)胞將分化為漿母細(xì)胞，并在該階段被抑制。通過綠色熒光蛋白(eGFP)可以觀察到腫瘤在各種組織中的存在。采用免疫組化、免疫組熒光和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)監(jiān)測增殖率、凋亡和致癌細(xì)胞通路的激活，如NF-κB、bcl-2、Myc 等。還使用超聲對小鼠進(jìn)行臨床監(jiān)測，特別是強(qiáng)調(diào)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的存在。②DTP3 可發(fā)展為一種安全有效的治療DLBCL 患者的方法：通過動物模型評估DTP3 的靶效應(yīng)(療效)程度以及脫靶效應(yīng)(不良反應(yīng))程度。將小鼠注射懸浮于重組基底膜制備的DLBCL 細(xì)胞和磷酸鹽緩沖鹽(PBS)，將在免疫抑制NOD/SCID 小鼠中建立異種移植DLBCL 小鼠模型。這些小鼠會出現(xiàn)兩種情況，一為由于FOXN1 突變而缺乏功能性胸腺，二為由于Prkdc突變而導(dǎo)致V(D)J重排受損。根據(jù)腫瘤體積、大小和直徑進(jìn)行判斷，小鼠將注射不同濃度的DTP3(DTP3 組)或生理鹽水(對照組)。然后在不同時間點(diǎn)處死小鼠，測量腫瘤體積和JNK 激活的細(xì)胞凋亡存在。將DTP3 組與對照組進(jìn)行比較，以研究DTP3 是否停止DLBCL 的進(jìn)展。如果觀察到陽性結(jié)果，將進(jìn)行TUNEL 檢測凋亡細(xì)胞，免疫印跡檢測存在磷酸化的JNK、活化半胱天冬-3(裂解)、滅活半胱天冬-3(未裂解)和PARP-1、半胱天冬-3 的蛋白水解底物。以期望證明DTP3 介導(dǎo)的Gadd45β 抑制導(dǎo)致JNK 激活，最終使腫瘤細(xì)胞凋亡。DTP3 在小鼠模型中的安全性研究顯示，對照組和DTP3 組之間的任何行為變化或明顯痛苦跡象進(jìn)行比較，信號可以來自眼睛、鼻、臉頰、胡須和耳朵等部位，來自其他組織或其他類型的免疫或造血細(xì)胞的細(xì)胞也將使用具有特定生物標(biāo)記物的微珠從小鼠中分離。將使用上述相同方法檢測意外的細(xì)胞凋亡或JNK 激活，以檢測DTP3 的任何脫靶效應(yīng)。③DTP3 在DLBCL 細(xì)胞系中靶向MKK7：此為確認(rèn)DTP3與MKK7的相互作用，從而確認(rèn)DTP3的治療機(jī)制。由于DTP3 和MKK7 的相互作用已經(jīng)在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中得到證實(shí)[9]，目的為觀察是否可以在DLBCL 細(xì)胞系中復(fù)制。選擇Gadd45β 高表達(dá)水平的DLBCL 細(xì)胞系，通過RT-PCR 證實(shí)這一點(diǎn)。DTP3 和MKK7 的相互作用將通過使用瓊脂糖快速流動樹脂的肽下拉實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。一旦確認(rèn)，細(xì)胞系將用DT3處理，并使用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞活力試驗(yàn)，以確認(rèn)DT3/MKK7相互作用與DLBCL 生長抑制之間的相關(guān)性。④DTP3逆轉(zhuǎn)Gadd45β 對MKK7的抑制并恢復(fù)其激酶活性：最后，確認(rèn)DTP3是否逆轉(zhuǎn)了Gadd45β對MKK7的抑制作用。進(jìn)行激酶活性，免疫沉淀的MKK7 和Gadd45β 將在細(xì)菌表達(dá)的純化JNK和標(biāo)記ATP的溶液中，首先測量不添加DTP3的MKK7活性，然后在添加DTP3后確認(rèn)MKK7的激酶活性是否按預(yù)期進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。

結(jié) 語

綜上所述，50% 的DCBLC 患者對標(biāo)準(zhǔn)的RCHOP 治療方案反應(yīng)良好，復(fù)發(fā)或難治性病例的預(yù)后一般較差。目前R-CHOP 替代方案無顯著效果，且有不良反應(yīng)。DTP3 在多發(fā)性骨髓瘤中顯示了進(jìn)一步研究的可能性。如果DLBCL 中的DTP3 產(chǎn)生與多發(fā)性骨髓瘤相似的結(jié)果，那么可以相對安全地假設(shè)相同的結(jié)果可以在劫持Gadd45β/MKK7 復(fù)合物的其他類型癌癥中復(fù)制。在淋巴瘤、肝細(xì)胞癌、垂體促性腺激素腫瘤和結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了Gadd45β的不調(diào)控表達(dá)。此外，如上所述，以癌癥類型特異性的方式靶向NF-κB通路一直很困難，如果DTP3抑制DCBLC 的生長，則可以作為DCBLC的選擇性NF-κB抑制劑。這可能說明特定的NF-κB 抑制劑只能通過途徑本身的成分實(shí)現(xiàn)，也可以通過特定的下游效應(yīng)因子，如Gadd45β實(shí)現(xiàn)。