血管擬態在惡性腫瘤中的爭議及其意義

時 欣, 陳 玨

(1. 揚州大學醫學院附屬泰州市第二人民醫院 腫瘤科, 江蘇 泰州, 225500;2. 揚州大學附屬醫院, 江蘇 揚州, 225000)

1 前 言

血管擬態(VM)是發生于實體腫瘤內的無內皮細胞參與的血管結構，由腫瘤細胞獨立形成，為腫瘤細胞提供氧氣和營養[1]。盡管眾多學者在多數實體瘤樣本中檢測出VM，并證明其與腫瘤的不良預后相關，且近年來大量的基礎研究也證實了VM的形成及其相應機制，但學術界仍存在眾多爭議。本研究針對VM相關的爭議性話題進行回顧性綜述。

2 血管擬態的定義及功能

VM用于描述腫瘤細胞“模擬”內皮細胞，形成管狀結構并承載體液傳導功能的過程。作為一種病理性腫瘤血管, VM具有供氧、營養轉運和轉運細胞代謝廢物的功能[2]。在腫瘤早期尚無內皮依賴性血管長入的階段，上述功能是侵襲性腫瘤早期生長進展的關鍵保障。目前對VM血管的結構定義為: 腫瘤細胞與周圍富含糖蛋白的基質膜共同形成的管狀結構，內部可見循環細胞[3]。內皮依賴性血管和VM可以根據結構和成分的差異進行CD34/31-PAS的染色以識別和區分，這一方法已成為VM檢測的標準方式。

3 血管擬態的病理結構爭議

自從1999年VM概念首次提出后，多數學者已接受VM這一觀點，而部分學者則對此持質疑態度，認為VM只是發生在腫瘤內部的一種空腔結構，為誤判的血管結構。一般認為, VM的存在是通過腫瘤內過碘酸雪夫染色(PAS)陽性且內皮細胞標記陰性的血管樣結構而推斷的。因此, VM被認為是一種獨立于血管生成之外的腫瘤灌注途徑。然而，有學者[4]質疑這僅僅是腫瘤內皮細胞結構不穩定和微出血引起的血液積聚的“偽影”結果，認為VM僅僅是組織獲取養分過程中產生的“血池”。但是“血池”與VM確實存在差異。如果VM是光鏡下觀察到的血池，那么紅細胞就不會被封閉在PAS及管道結構中。部分研究[5]基于腫瘤橫切面上的管腔空間假設VM的存在，但是不存在PAS及邊界。同樣，弱PAS染色可以排除基質膜的存在，從而判斷為血池[6]。研究[7]報道在多數實體瘤樣本中存在含有紅細胞的PAS(+)/CD31(-)結構。這些研究證明了VM[PAS(+)/CD31(-)]和血管[PAS(+)/CD31(+)]在同一區域內的存在。SCULLY S等[8]及其同事對膠質母細胞瘤的研究顯示, CD31、CD34和/或血管內皮(VE)-鈣黏蛋白陽性(內皮依賴性血管)和陰性(VM)管腔結構的存在; 這項研究還表明，內皮依賴性血管呈現α-平滑肌肌動蛋白陽性，而VM結構中則表現為陰性。這些文獻證明實體腫瘤中存在VM。

4 血管擬態的檢測標準

目前為絕大部分學者所接受的VM檢測為內皮細胞表面標記物CD31或者CD34的免疫組化染色聯合基質膜的PAS化學染色，在此基礎上確認觀察到含有紅細胞的PAS(+)/CD31(-)的空腔結構為VM。然而，部分學者對此尚有爭議。腫瘤細胞具有分泌大量黏蛋白的能力，由此造成PAS染色陽性，但這并不意味著它們正在形成管狀結構。MANIOTIS A J等[9]通過電鏡掃描證實VM內部存在血液成分。因此，在缺乏可靠的VM生物標志物的情況下, PAS(+)和經典EC標志物(如鈣黏蛋白、CD34或CD31)的結合，加上明確定義的管腔中的紅細胞，應該是目前VM檢測的最佳標準。

5 血管擬態的臨床意義

大量研究[10]表明VM與腫瘤患者生存率的降低有關，VM在腫瘤組中的檢出往往提示較短的總生存期(OS)或無進展生存期(PFS)。一項Meta分析研究[11]比較了20種不同病理類型腫瘤中VM(+)和VM(-)的OS水平，除滑膜肉瘤外，其余19種腫瘤證實VM(+)與OS降低有關，其中卵巢癌和結直腸癌中VM陽性對生存期的影響最明顯。在眼眶橫紋肌肉瘤和腎上腺皮質樣癌中同樣觀察到類似的差異[12-13]。有PAS(+)結構的胃癌患者易出現較高的組織學分級、轉移、遠處復發和OS下降[14]。同樣, VM(+)前列腺癌患者與Gleason評分、術前前列腺特異性抗原(PSA)水平、病理分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關。迄今為止，關于VM與其臨床價值的研究主要集中在中國人群，部分分散性研究則涉及歐洲、日本、北美和泰國人群。腫瘤發病率及腫瘤類型在特定人群中具有明顯的差異，因此在擴大人種情況下VM對腫瘤預后的影響需要進一步研究。總之，目前多數研究認為VM常見于高度侵襲性腫瘤，并與不良預后相關。因此，針對這一特異性細胞亞群的深入研究可能有助于改善患者的生存獲益。

6 血管擬態在不同腫瘤中的陽性檢測率

并非所有惡性實體腫瘤都能檢測出VM。研究[15]顯示，由于腫瘤病理類型的差異以及研究標準的差異, VM在不同病理類型惡性腫瘤中的陽性檢測率在5.0%～65.0%; VM的平均陽性率約為29.0%, 其中膠質母細胞瘤在所有腫瘤類型中的檢出率最高(65.9%), 同時膠質母細胞瘤患者的VM類型也具有顯著的異質性。有研究報道膠質母細胞瘤患者樣本中VM(+)檢出率為65.9%, 然而兩個類似的研究報告膠質母細胞瘤中VM陽性率為26.0%[16]和16.0%[17]。顯然，患者和/或腫瘤特征(如腫瘤分期或組織學分級)可能是導致VM陽性率的影響因素。

7 體內爭議之VM的動物模型

在所有體內腫瘤模型中，小鼠異種移植是VM研究的標準。在一項基礎研究[18]中，將人乳腺癌細胞移植于小鼠皮下，通過蘇木精-伊紅(HE)染色，可能會導致將VM誤解為腫瘤內出血引起的血池。同樣，在前列腺小鼠皮下移植瘤中，利用HE染色聯合PSA染色將內皮依賴性血管誤判為VM[19]。有研究[3, 20]首次使用PAS(+)/CD34(-)組合在B16黑色素瘤小鼠皮下移植模型中，該研究證實了PAS/CD34雙染色結合管腔中紅細胞的存在這一經典方法在VM判斷中的價值，為后續VM的研究提供了標準參考。在此研究之后，多個研究[18, 21]報道PAS(+)/CD31(-)或PAS(+)/CD34(-)(VM)結構，這些研究提供了PAS(+)/CD31(-)染色結構的確鑿證據，這些結構的管腔中也含有紅細胞。然而，在某些情況下，低質量或低分辨率圖像未能證明紅細胞的狀態或存在。

目前尚無體內鑒定VM的方法。PAS(+)染色不能保證VM的存在，因此迫切需要區分VM和血池的新的生物標志物。作為潛在的生物標記物, BAJCSY P等[22]使用3D Z-stack重建來識別轉移性眼色素層黑色素瘤樣本中的層黏連蛋白和CD34的腫瘤內結構。最近的一項研究使用泛層黏連蛋白抗體和EC結合凝集素來鑒定人膠質母細胞移植瘤中的VM結構[23], 該研究證明了凝集素陽性管狀結構的存在。上述結果表明，這些管狀結構的黏蛋白含量和組成可能有很大差異。因此，未來的研究將致力于識別CD31(-)血管內的特異性黏蛋白，可能是特異性凝集素或其他細胞外基質(ECM)成分，從而改進目前的VM識別方法。

8 VM形成的分子信號

8.1 基質金屬蛋白酶(MMPs)與細胞外基質成分

許多研究提示MMPs在VM中的作用。SOOD A K等[24]首次證明VM(+)與卵巢癌樣本中金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14的表達存在相關性。這些研究也報道了VM(+)與層黏連蛋白-5T-2的關系。MMPs和層黏連蛋-5T-2是黑色素瘤形成VM必需的蛋白結構[25]。在前列腺癌中，VM(+)與層黏連蛋白和整合素α6β1相關[26], 在間皮肉瘤和肺泡橫紋肌肉瘤中與Ⅳ型膠原纖維相關[11]。2008年DEMOU Z N[27]報道VM(+)與整合素α3亞單位的存在有關。由于體外VM僅發生在ECM替代物上，因此可以合理地假設該過程需要通過MMPs進行ECM重塑。

8.2 PI3K-AKT通路

HESS A R等[28]研究首次涉及PI3K-AKT通路與VM的關系。隨后，該研究團隊提出黏著斑激酶(FAK)參與VM形成的分子機制。FAK是PI3K通路的上游成分和整合素信號通路的重要成分[29-30]。兩項相關研究[31-32]表明, VM結構分別與黑色素瘤和膽囊癌中的AKT[31]或MMPs、PI3K、FAK[32]相關。目前。學術界已普遍認為, PI3K通路是VM形成的確切分子信號，這也為將來干預治療的可能性提供了機會。

8.3 血管生成信號通路

由于VM是腫瘤細胞模擬血管內皮細胞產生具有循環功能的血管樣結構，因此多數學者猜測它們具有共同的信號通路。然而, VM與血管生成的關系是一個有爭議的話題。研究[8, 18]報道血管生成信號通路在VM中起作用, VM(+)與腫瘤標本中血管內皮生長因子(VEGF)或血小板衍生生長因子受體β(PDGFRβ)的表達相關。另一個與VM相關的因子是缺氧誘導因子1α, 其廣泛參與促血管生成途徑的相關分子信號的刺激與活化[33-34]。然而，與此形成鮮明對比的是，一些報告[23, 35-36]表明抗血管生成治療如抗血管內皮生長因子或其受體的治療對VM形成沒有影響，甚至會促進VM的形成，這表明血管生成與VM形成過程中活化信號的不一致性。事實上，在抑制血管生成信號過程中可能會誘導促VM信號，這些信號能夠促進腫瘤細胞的表型轉變及惡化[32, 37-38]。顯然，目前對VM及血管生成中的共同信號通路尚缺乏精確的研究依據。

9 其他信號通路

抗體抑制實驗[39]表明，組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)在體外是VM所必需的，阻斷TFPI-2可以抑制MMP2的激活。但這是否表明凝血級聯參與VM, 或這些蛋白質的非穩態作用可能參與了VM的信號活化，具體的分子機制尚需要進一步研究。鑒于VM是一種具有循環功能的管狀結構，VE鈣黏蛋白(VE-CAD)與VM的相關性也在多數研究中有所報道[40]。VE鈣黏蛋白是血管內皮細胞[41]中穩定表達的跨膜蛋白。HENDRIX M J C等[42]研究證實了VE-CAD在黑色素瘤細胞VM形成中的作用。有研究[43-44]報道，在黑色素瘤中VE-CAD促進血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1)信號傳導，進而促進PI3K/PKC通路的信號活化，對VM的信號啟動至關重要。Wnt信號通路和上皮細胞-間充質轉化(EMT)通常與腫瘤、血管生成和發育有關，也與VM的形成有關[45-46]。Wnt3a和β-連環蛋白被證明能增加結腸癌中VM的形成[47]。腫瘤細胞的上皮間質轉化是腫瘤細胞惡性表型轉變的一種方式，研究[48-49]證明EMT參與VM形成，在EMT過程中, Slug、Snail和Twist被證實與VM形成相關。

10 小 結

抗血管生成目前被廣泛應用于實體瘤的治療，并給患者帶來了實質性獲益。然而，抗血管生成往往不單獨使用，在抑制腫瘤生長方面尚缺乏有力證據，這可能與腫瘤細胞通過替代/代償途徑、血管協同或VM形成[37]來補償血管生成抑制有關。作者推測VM在腫瘤的發生和抗血管生成治療的逃逸中起著關鍵作用。研究VM發生的確切分子機制，有助于開發生物標記物、藥物發現和對抗血管生成難治性患者進行更有效的治療。