高速剪切均質對雞肉肌原纖維蛋白乳化特性和結構的影響

韓柯穎，楊玉玲*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

脂肪是肉制品的重要原料之一，能夠直接影響肉品的感官、營養、安全等特性。利用植物油替代動物脂肪能減少脂肪帶來的膽固醇和飽和脂肪酸含量，并且能較好保持肉制品的整體風味。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是畜禽肌肉中含量最高的蛋白質，其乳化特性對乳化型肉糜類制品的保水保油性、質地等均有顯著影響。因此，已有許多學者研究了不同種類油脂條件下MP的乳化性及其結構變化。吳滿剛[1]比較在分別添加花生油和豬油的條件下，豬肉MP的乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）、乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）和二級結構。孫迪[2]在分別添加豬油、大豆油、黃油的條件下，測定豬肉MP的EAI、ESI和二級結構，發現在添加大豆油時MP的乳化穩定性最好，添加豬油居中，添加黃油時最差，并認為乳狀液的穩定性與二級結構有關。陳晨[3]分別利用魚油、棕櫚油、玉米油制備牛肉MP乳液，結果表明，含15%魚油的MP乳液的乳化穩定性最好。作為我國特有的植物油，山茶油含有多種天然抗氧化物，如茶多酚、山茶苷，能預防多種疾病的發生并延緩衰老[4-6]。Wang Xiaoxi等[7]制備山茶油凝膠乳液來替代部分哈爾濱香腸中的豬肉脂肪，發現哈爾濱香腸的品質得到改善。Luo Shuizhong等[8]制備了以山茶油乳液為基質的脂肪替代品，通過穩定性測試、微觀結構、流變學特性等表征發現，乳液具有優良的貯藏穩定性和乳化特性。Zhou Xi等[9]利用山茶油、魔芋葡甘露聚糖、角叉菜膠制備涂膜劑，此涂膜劑能抑制雞肉中脂質和蛋白質的氧化。本團隊研究了添加山茶油對雞肉MP凝膠特性的影響[10-11]，但目前少有關于研究山茶油對雞肉MP乳化性影響的報道。

高速剪切均質（high-speed shear homogenization，HSSH）是制備乳狀液的技術之一，能使油脂短暫、快速地分散在水相中，并在乳化劑的作用下形成乳液。Kong Xiangzhen等[12]報道，HSSH處理能顯著提高核桃飲料的穩定性。Zhou Lei等[13-14]研究不同HSSH處理條件下MP凝膠特性和結構的變化趨勢。Li Ruren等[15]研究不同剪切均質速率對MP-橄欖油乳液穩定性的影響。目前關于HSSH處理對MP乳化特性影響的報道幾乎沒有。本研究旨在探討在山茶油存在條件下，不同剪切速率和時間的HSSH處理對MP乳化活性、乳化穩定性、二級結構和三級結構的影響，并測定與之相關的溶解度和粒徑變化，為HSSH技術應用于乳化型肉制品加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉雞（質量約2 kg）購于南京市一養雞場，屠宰后取雞胸肉并存放在冰箱冷凍室中。

山茶油 杭州久晟生物科技有限公司；乙醇、KH2PO4、KCl、HCl、K2HPO4、NaN3、二硫蘇糖醇、十二烷基硫酸鈉、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Avanti J-26XP高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；T10 Basic高速剪切均質機 德國IKA公司；U-3900紫外分光光度儀、F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；LABRAM 800激光拉曼光譜儀 法國Jobin Yvon公司；Nano-ZS90 Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司。

1.3 方法

1.3.1 MP提取

將雞胸肉從冰箱中取出化凍20 min后，先去除包膜等雜質，再切成體積約1 mm3的小肉丁，挑出帶結締組織和脂肪的小肉丁棄去，剩余的純肌肉丁用Han Keying等[16]的方法提取MP。

1.3.2 樣品處理

用磷酸鹽-氯化鉀緩沖液（含10 mmol/L KH2PO4、0.6 mol/L KCl，pH 6.0）配制質量濃度為10 mg/mL的MP溶液。取24 mL MP溶液于100 mL燒杯內，加入6 mL山茶油并充分混合，用高速剪切均質機對混合液進行HSSH處理，在預實驗的基礎上，將剪切速率確定為11 500、14 500、20 500 r/min，時間確定為3、5、7 min，對2因素的3水平進行組合，共得到9 組不同HSSH處理的新鮮乳液。此新鮮乳液直接用于MP溶解度的測定；將乳液稀釋為MP質量濃度分別為1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL，用于表面疏水性的測定；MP質量濃度為1 mg/mL的乳液用于除溶解度和表面疏水性外的其他指標測定。

1.3.3 乳化活性和乳化穩定性測定

利用紫外分光光度計測定MP-山茶油乳液中MP的EAI和ESI[17]。取0.050 mL稀釋乳液與5 mL 0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉充分混合后，在500 nm波長處測定吸光度（A0）。將稀釋乳液放置3 h再取0.050 mL進行同樣的處理后測定吸光度（A1），EAI和ESI分別按照式（1）～（2）計算。

式中：ρ為MP質量濃度/（g/mL）；φ為油脂體積分數（0.2）；DF為稀釋因子（100）。

1.3.4 溶解度測定

將1.3.2節制備的新鮮乳液進行冷凍離心（10 000×g、10 min、4 ℃），MP的溶解度按式（3）計算，實驗重復3 次[18]。

1.3.5 粒徑測定

采用Zeta電位儀測定乳液的粒徑，測定參數為：散射角90°、平衡時間2 min、溫度25 ℃。實驗重復測定3 次。

1.3.6 二級結構測定

參照本實驗室Zhang Ziye等[19]的方法，用拉曼光譜儀進行測定。設定拉曼光譜的激光波長和頻率分別為515 nm和10 mW，狹縫為200 μm。將樣品置于載玻片上，調節好焦距，測定波數400～2 000 cm-1內的伸縮振動強度。通過波數1 660～1 670 cm-1內的強度變化對MP的二級結構含量進行測定。各處理組進行3 次平行實驗。

1.3.7 表面疏水性測定

使用熒光分光光度計測定乳液中MP表面疏水性（S0）[20]。測定前預先將經HSSH處理的新鮮乳液進行稀釋，得到MP質量濃度分別為1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL的系列乳液樣品。將4 mL樣品分別與20 μL ANS緩沖液（含8 mmol/L ANS、0.1 mol/L K2HPO4，pH 6.0）反應25 min后進行測定。

1.3.8 活性巰基含量測定

采用Zhang Ziye等[20]的方法測定樣品中活性巰基含量。將5.5 mL稀釋乳液與0.1 mL Ellman試劑（含0.01 mol/L DTNB、0.01 mmol/L K2HPO4，pH 6.0）混合均勻并反應完全后，用紫外分光光度計測定其吸光度。測定條件為波長412 nm、比色皿厚度1 cm。按照式（4）計算巰基含量，各處理組進行3 次平行實驗。

式中：ρ為MP質量濃度/（g/mL）；D為稀釋系數（D=1.02）。

1.4 數據處理

使用SPSS 24.0軟件進行方差分析，采用Duncan’s multiple range test分析各組間顯著差異性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同剪切處理條件下MP的乳化活性和乳化穩定性

由圖1可知：當剪切時間一致，即同為3、5 min或7 min時，隨著剪切速率增加，MP的EAI均呈顯著升高趨勢，且剪切7 min的樣品均明顯高于剪切3、5 min的樣品；而剪切速率相同時，EAI隨剪切時間延長而顯著增加（P＜0.05）；20 500 r/min、7 min和115 00 r/min、3 min分別是EAI獲得最大值和最小值的處理條件。機械剪切能導致蛋白質一定程度的變性，分子鏈展開，疏水基團暴露，從而改變其乳化性能[21]。Zhou Lei等[14]研究雞脂肪乳液中MP的乳化活性時也發現，HSSH處理能增加MP的EAI。

圖1 不同剪切速率和時間條件下MP的EAIFig.1 EAI of MP at different shear rates and times

由圖2可知：在剪切速率14 500 r/min條件下，ESI幾乎不受剪切時間影響且均獲得較高值（＞90%），說明此剪切速率下的乳液穩定性最好；而低于和高于此速率時，延長剪切時間對ESI造成顯著的不良影響（P＜0.05），特別是經20 500 r/min、7 min處理的樣品，在放置3 h后甚至出現了肉眼可見的分層狀態，ESI降低到2.45%。分析相同剪切時間、不同剪切速率對ESI的影響時發現，在剪切3 min時，剪切速率14 500 r/min與20 500 r/min對ESI沒有顯著影響，但顯著優于11 500 r/min；剪切時間為5 min和7 min時，剪切速率14 500 r/min時的ESI明顯高于其他2 個剪切速率。依據EAI和ESI進行評價，發現HSSH處理條件為14 500 r/min、7 min時，MP具有較好的乳化活性和乳化穩定性。

圖2 不同剪切速率和時間條件下MP的ESIFig.2 ESI of MP at different shear rates and times

2.2 不同剪切處理條件下MP的溶解度

由圖3可知，剪切速率為14 500 r/min乳液中MP溶解度明顯高于剪切速率11 500 r/min和20 500 r/min乳液中MP溶解度。在剪切速率為14 500 r/min乳液中，剪切時間3 min時MP溶解度獲得最大值70.36%，顯著高于處理5 min時的67.76%和處理7 min時的61.19%。MP溶解度最小值的處理條件為20 500 r/min、7 min，僅為16.42%。適當的HSSH處理能打散MP的聚集狀態，使MP分子均勻分散，增加其與水和油的接觸面積，從而導致其溶解度和乳化性能的增加[14]。但過度的HSSH處理導致MP溶解度降低，這可能是MP分子變性程度增大引起的。這種HSSH處理與超聲波處理導致蛋白質溶解度的變化趨勢一致[22]，而HSSH處理與超聲波處理均能產生空穴效應[23]。

圖3 不同剪切速率和時間條件下乳液中MP的溶解度Fig.3 Solubility of MP in emulsions at different shear rates and times

2.3 不同剪切處理條件下乳液的液滴粒徑

由圖4可知：剪切速率為11 500 r/min時，剪切3 min的乳液粒徑顯著高于剪切5、7 min的乳液粒徑（P＜0.05）；而剪切速率為14 500、20 500 r/min乳液中，樣品粒徑均隨剪切時間延長而明顯增大。HSSH處理條件為14 500 r/min、3 min和20 500 r/min、7 min時，乳液樣品粒徑分別出現最小值和最大值。機械剪切能打斷蛋白質間的非共價鍵，導致其聚集體解聚，因而能降低樣品粒徑，但過度處理則導致顆粒發生聚集。Zhou Lei等[14]在對MP-雞脂乳液進行高速剪切處理1 min時也發現，剪切速率低于14 500 r/min時能降低乳液粒徑，剪切速率進一步增大則導致乳液粒徑迅速增大。對蛋白質進行高壓均質處理時也出現相似的趨勢，即適當的均質處理能降低蛋白質粒徑，而過度處理則引起蛋白質分子聚集[24-25]。

圖4 不同剪切速率和時間條件下乳液液滴的粒徑Fig.4 Emulsion droplet size at different shear rates and times

2.4 不同剪切處理條件下MP的二級結構

由圖5和表1可知，11 500、14 500 r/min組乳狀液中MP的α-螺旋、β-轉角、β-折疊和無規卷曲結構含量隨時間延長變化趨勢均一致，即前2 個指標隨著時間延長逐漸下降，后2 個指標則顯著升高（P＜0.05）。剪切速率為20 500 r/min組的乳狀液中，α-螺旋含量隨著時間延長顯著升高（P＜0.05），β-轉角含量沒有發生顯著變化，β-折疊和無規卷曲含量則逐漸降低。Zhou Lei等[14]對MP進行HSSH處理時，其α-螺旋和β-折疊的含量變化趨勢與11 500 r/min、14 500 r/min組乳狀液的變化趨勢一致，并且他們認為MP的二級結構展開有助于乳化性的提高。

圖5 不同剪切速率和時間條件下乳液中MP的拉曼光譜Fig.5 Raman spectra of MP in emulsions at different shear rates and times

表1 不同剪切速率和時間條件下MP的二級結構含量Table 1 Secondary structures of MP in emulsions at different shear rates and times%

2.5 不同剪切處理條件下MP的表面疏水性

蛋白質三級結構的形成是不同基團之間相互作用的結果，疏水氨基酸殘基的重新分布是蛋白質高級結構改變的重要特征之一[26]，因此通過蛋白質疏水氨基酸殘基的暴露情況可以從側面反映蛋白質三級結構的變化[27]。

由圖6可知：11 500 r/min與14 500 r/min組乳狀液中MP的S0隨剪切時間延長變化趨勢一致，剪切5 min時樣品的S0比剪切3 min時略大，并明顯大于剪切7 min時的S0；20 500 r/min組乳狀液中MP的S0隨剪切時間延長而顯著增加（P＜0.05）。在所有9 份處理樣品中，獲得S0最大值的處理條件為20 500 r/min、7 min，表明此時MP的三級結構最大程度展開，暴露出最大量的疏水基團。蛋白質的S0適當增加能使其具有更好的乳化性[28]；但過度的HSSH處理（如20 500 r/min、7 min）卻導致MP的乳化穩定性明顯變差（圖2），Zhou Lei等[14]用HSSH處理雞脂肪-MP乳液時也得到了相同的結論。這是因為分布在蛋白質表面的大量疏水基團之間產生了強烈的疏水相互作用，乳液間相互吸引，因此乳液的穩定性變差，液滴間容易發生聚集。處理條件為20 500 r/min、7 min的樣品S0、ESI和粒徑之間的關系為上述觀點提供了證據。

圖6 不同剪切速率和時間條件下MP的S0Fig.6 S0 of MP in emulsions at different shear rates and times

2.6 不同剪切處理條件下MP的活性巰基含量

活性巰基是指暴露在蛋白質分子表面的巰基[29]，活性巰基變化能從另一個側面反映出蛋白質三級結構的變化[23]。由圖7可知：對相同剪切速率的3 組乳狀液而言，MP活性巰基含量均隨剪切時間延長而逐漸增加；對剪切時間相同的3 組乳狀液而言，MP活性巰基含量則均隨剪切速率增加而顯著增加（P＜0.05）。在所有9 份處理樣品中，11 500 r/min、3 min和20 500 r/min、7 min分別是活性巰基含量最小值和最大值的樣品處理條件。說明剪切時間延長、剪切速率增加均導致MP三級結構破壞程度增加，更多的巰基基團暴露于蛋白質分子表面。活性巰基含量與S0獲得最大值的HSSH處理條件相同，2 個指標從不同側面反映了MP分子三級結構的展開程度。MP分子高級結構的過度展開會導致乳液的穩定性下降。大豆蛋白的ESI也隨著活性巰基含量增加出現先增加后下降的變化趨勢[30]。

圖7 不同剪切速率和時間條件下乳液中MP活性巰基含量Fig.7 Reactive sulfhydryl content of MP in emulsions at different shear rates and times

3 結 論

MP-山茶油乳液中MP的EAI隨剪切速率（11 500～20 500 r/min）增加和剪切時間（3～7 min）延長而增大。在20 500 r/min條件下處理7 min時，乳液的乳化活性最好但乳化穩定性最差，放置3 h后ESI降到2.45%；在剪切速率為14 500 r/min時，ESI幾乎不受剪切時間影響且均獲得高值（＞90%）。綜合EAI和ESI，HSSH處理MP乳液的最佳條件為14 500 r/min、7 min。剪切速率為14 500 r/min的處理組MP溶解度最高。剪切速率為11 500 r/min與14 500 r/min組乳狀液中MP的二級結構含量隨剪切時間延長變化趨勢一致，即α-螺旋和β-轉角含量隨剪切時間延長逐漸下降，β-折疊和無規卷曲含量顯著升高（P＜0.05）；剪切時間與剪切速率的增加均導致MP三級結構破壞程度增加，更多疏水基團和巰基基團暴露于蛋白質分子表面。活性巰基含量與S0均在20 500 r/min條件下剪切7 min后獲得最大值。MP分子的二、三級結構變化顯著影響其乳化特性。適當的HSSH導致MP分子適度展開，改善MP的乳化活性和乳化穩定性；但過度剪切卻致使乳狀液失穩，這是由于分布在蛋白質表面的大量疏水基團之間能產生強烈的疏水相互作用，乳液液滴間相互吸引，更易發生聚集，因此乳液的穩定性變差。