生物保護菌聯合氣調包裝應用于肉品中抑菌保鮮的研究進展

馬 靜，張 潮，劉 騫，陳 倩，孔保華*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

隨著生活水平的提高，消費者對于肉類食品的需求量日益增加。截止到2020年，我國城鎮人口人均肉類消費量達27.4 kg，農村人口人均肉類消費量達21.4 kg，全國居民人均肉類消費量達24.8 kg[1]，由此可見，肉類食品在人們的飲食中占據著重要地位。然而，由于肉及肉制品中營養物質豐富、水分含量較高，容易導致其在加工、運輸及銷售過程中滋生腐敗菌，引發肉品腐敗變質，從而影響肉的食用安全性及貨架期[2]。一些研究表明，迷迭香和甘草等混合植物香料作為天然防腐劑對肉類中常見的腐敗菌和致病菌（單核細胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌）等具有良好的抑菌效果[3]。但植物香料的添加通常會影響肉品的風味、顏色和口感，這會降低消費者對此類肉品的選擇。部分生產商也會采用真空包裝或者添加化學防腐劑的方式來延長肉品保質期。雖然真空包裝可以在一定程度上延長肉品保質期，但真空條件也會影響肉色，并加劇肉品汁液損失，從而降低肉品營養價值。化學防腐劑對人體可能具有潛在的毒性，因此會引發一定的安全問題。由于目前肉及肉制品的保鮮方式種類多樣，保鮮效果也參差不齊[4]，因此，科學、合理地選用保鮮方式至關重要。氣調包裝是目前采用較多的一種保鮮技術，其是指在一定的溫度條件下，向高阻隔性的材料（塑料托盤和封蓋膜）內充入O2、N2、CO2等混合氣體的物理保鮮技術。氣調包裝改變了產品所處的環境，同時也阻礙了外界空氣的進入，這可以更好地抑制微生物生長并延緩酶促反應，從而延長產品貨架期。生物保護菌是指可以添加到食品中的、延長食品貨架期、抑制致病菌生長的活的微生物，氣調包裝和生物保護菌皆具有安全、環保的特點，將其聯合應用于肉品中可達到比較理想的抑菌防腐效果[5]。因此，本文主要介紹氣調包裝常用氣體和生物保護菌的抑菌機理，以及二者聯合在肉品中的應用，以期為生物保護菌聯合氣調包裝的保鮮方法在食品科學領域的應用提供理論參考。

1 氣調包裝的常用氣體

氣調包裝是一種利用氣體保鮮的物理技術，常用的填充氣體主要有O2、N2、CO2和CO等[6]。填充氣體的種類和比例會影響肉及肉制品的色澤、口感、微生物數量和種類以及貨架期。

肉品的顏色可以反映肉質的好壞，影響消費者的購買欲[7]。肌紅蛋白是影響肉類顏色的主要蛋白質[7]。在O2存在條件下，肌紅蛋白易與O2結合形成氧合肌紅蛋白，使得肉品表面呈現出相較于原來更深的紅色。然而過高的O2濃度則會導致肌紅蛋白過度氧化而呈現令人不悅的褐色。因此，適合的O2含量可以更好地維持肉品的視覺新鮮度[8]。Bassey等[9]研究氣調包裝豬里脊肉冷藏過程中品質特性的變化。結果發現，與對照組相比，在含有70% O2的氣調包裝中豬肉具有較高紅度值。Esmer等[8]研究不同O2含量對冷藏條件下碎牛肉色澤的影響。結果表明，與對照組相比，50% O2/30% CO2/20% N2的氣體比例可以更好地維持牛肉色澤的穩定性。以上結果表明，在氣調包裝中，O2比例居于主導地位可以更好地保護肉品色澤。Spanos等[10]研究經過氣調包裝后零售冷鮮肉中蛋白質和脂質的氧化程度。結果發現，在包裝內填充50% O2有助于維持豬肉中脂質和蛋白質的穩定性。因此，適當的O2比例不僅可以更好地維持肉品視覺新鮮度，而且還能夠有效維持肉品長時間運輸和銷售中脂質和蛋白質穩定性，從而更好地延長肉品貨架期。

N2是一種惰性氣體，性質比較穩定，常被用作氣調包裝的緩沖氣體。N2不會對肉的色澤產生負面影響，也不易被肉吸收，可抑制腐敗微生物的生長繁殖，延緩肉的腐敗進程。Bassey等[9]發現，與對照組相比，70% N2/30% CO2處理組顯著抑制了總活菌數和嗜冷菌數的增長，進而延緩了肉品的腐敗變質。

CO2易溶于水和油脂形成碳酸，使肉的pH值降低。較低的pH值可以有效抑制絕大部分微生物的繁殖，進而延長肉的保質期[11]。Yang Jun等[12]研究氣調包裝中CO2的存在對冷藏期牛肉中微生物種類和數量的影響。結果發現，經過氣調包裝（50% O2/40% CO2/10% N2；對照組：50% O2/50% N2）處理后牛肉中的微生物多樣性隨著貯藏時間的延長均呈現降低趨勢，同時CO2的存在明顯抑制了影響牛肉品質的腐敗菌生長。Zhang Xinxiao等[13]研究不同CO2濃度對黃羽雞冷藏期微生物數量和品質特性的影響，樣品分別置于空氣（4 ℃）、80% CO2氣調包裝和30% CO2氣調包裝條件下進行貯藏實驗。結果發現，對照樣品、80% CO2氣調包裝樣品和30% CO2氣調包裝樣品的總活菌數分別在貯藏4、10、8 d后達到7.0（lg（CFU/g））；結合其他理化指標和感官評價認為，高含量的CO2氣調包裝可將雞肉保質期延長至少6 d。以上結果表明，提高CO2含量可有效減少冷藏期間肉品中微生物的數量和種類。

CO可與肌紅蛋白結合形成鮮亮的櫻桃紅色，以改善肉的色澤，且CO還具有一定的抑菌效果[14]，尤其是對假單胞菌具有很好的抑制作用。但因CO具有一定的毒性，因此一些國家不允許在氣調包裝內添加CO。挪威肉類專家按照有毒氣體檢測的國際標準對氣調冷卻肉中使用CO氣體的毒性進行檢測后得出結論：低濃度CO（0.5%～1.0%）對消費者的危害可忽略不計[15]。

此外，惰性稀有氣體（氦氣、氬氣、氙氣、氖氣）也可作為氣調包裝中的填充氣體[16]。Claudia等[17]根據感官分析發現，含有70%氬氣的氣調包裝抑制了香腸中微生物的生長和繁殖，同時可將香腸保質期延長28 d。

在肉品中使用氣調包裝進行保鮮雖然可以在一定程度上延長貨架期，但仍存在一些缺點。例如，氣調包裝對所使用包裝材料的密封性有嚴格要求。如果包裝材料密封性出現問題，則容易導致內部氣體溢出，或者外界腐敗微生物進入，從而影響肉及肉制品的安全性和保質期。因此，利用生物保護菌對肉品進行保鮮就顯得尤為重要[18]。

2 生物保護菌的抑菌機理

生物保護菌作為一種天然、安全、高效的生物防腐劑可以有效抑制有害微生物的生長[2]。生物保護菌的主要作用機制是通過有益菌種產生的有機酸或細菌素來增加微生物細胞膜的通透性，進而抑制其生長[19-20]。此外，生物保護菌還可以通過微生物群體感應作用來抑制有害微生物的生長和生物膜的形成[21]，同時其也會與有害微生物產生競爭，來抑制有害微生物的生長繁殖[20]。目前，在食品保鮮中最常用的生物保護菌是乳酸菌。研究表明，在冷藏溫度下，乳酸菌對新鮮牛肉、豬肉、家禽和魚肉等食品中的腐敗細菌和病原體的生長具有良好的拮抗作用[18]。

2.1 有機酸類物質抑菌

乳酸菌在代謝過程中會產生乙酸、乳酸、檸檬酸等有機酸，這些酸性物質具有一定的抑菌殺菌作用[22]，特別是對食品中的大腸桿菌和單核細胞增生李斯特氏菌[23]。乙酸與乳酸均為主要的抑菌物質，其中乙酸對霉菌可以起到較強的抑制作用。Trzaska等[24]證實了乙酸對霉菌具有抑菌和殺菌特性，其中體積分數0.3%乙酸能夠有效抑制孢子的萌發和真菌生長。乳酸可以更好地抑制有害微生物的生長，起到延長食品保質期的作用[25-26]。而檸檬酸可殺滅細菌芽孢，降低微生物的抗熱性，這有助于有效抑菌和殺菌[27]。有機酸的抑菌機制主要分為以下幾種。

2.1.1 能量競爭和提高胞內滲透壓

有機酸一般以解離或未解離的狀態存在。其中，未解離的有機酸可以直接通過細胞膜，進入微生物細胞內[28]。有害菌體細胞內環境偏堿性，這有助于有機酸解離產生更多氫離子和酸根離子。然而，酸根離子的產生會導致細胞內滲透壓增高。為了使胞內胞外滲透壓達到平衡，胞內的酸根離子會釋放到胞外。但是酸根離子不能通過自由擴散的方式通過細胞膜排出體外[29]，需要以消耗ATP的方式運輸到胞外。這加劇了有害菌能量的消耗，同時也會抑制有害菌正常代謝，從而減緩其生長繁殖[30]。此外，在向細胞外釋放酸根離子時也可能會將有害菌所需的前體物質及輔助因子一同轉移到細胞外，從而致使細菌生長受到抑制[31]。而有害菌胞內過多的離子流失會致使大量鉀離子泵入到胞內，從而增加胞內滲透壓，致使有害菌細胞膜破裂，內容物流出，最終抑制有害菌的生長[32]。

2.1.2 破壞細菌細胞膜

有機酸易與有害菌細胞膜上的脂類多糖反應，這會破壞有害菌細胞膜結構，降低細胞膜的穩定性[32]，增加細胞膜的通透性，破壞細胞膜的物質跨膜運輸，同時也會使得菌體內容物流出，進而起到抑菌殺菌作用[20]。

2.1.3 抑制大分子物質的合成

有機酸還可以通過干擾有害菌體內生物酶系的合成來影響其DNA的復制，從而抑制有害菌生長繁殖，最終達到抑菌效果[25]。Rasch[33]研究指出，羅伊氏乳桿菌產生的有機酸可抑制DNA合成中第1步反應所需的核糖核酸還原酶活性，從而干擾有害菌DNA復制，抑制其生長。

2.2 細菌素類物質抑菌

細菌素是細菌在代謝過程中由核糖體合成的具有殺菌效果的多肽或蛋白質類抗菌物質[20]，其具有抗食源性致病菌和食品腐敗菌的特性，可以作為天然、無毒的抗菌劑[34]。細菌素會破壞革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌細胞膜（壁）的通透性和完整性，促使細胞內容物流失，進而影響有害菌代謝和生長[35]，最終致使其死亡。例如，經細菌素A32處理后的大腸桿菌表面會變得粗糙，當細菌素A32濃度升高時，菌體細胞會發生嚴重破裂，同時有明顯的孔洞形成。同理，用細菌素A32處理金黃色葡萄球菌后也會在其表面發現類似的現象[35]。細菌素主要分為Ⅰ類羊毛硫細菌素、Ⅱ類肽類細菌素和Ⅲ類熱敏感大分子蛋白三大類[36]。

2.2.1 Ⅰ類羊毛硫細菌素

羊毛硫細菌素中研究最多的是乳酸鏈球菌素（nisin）[36]。Nisin是由乳酸鏈球菌產生的一類含有陽離子的多肽，是目前世界上唯一被允許用作食品添加劑的細菌素[37]。Nisin對革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌的孢子均具有強烈的抑制作用，Nisin在與冷凍、加熱、低pH值、乙二胺四乙酸及表面活性劑處理結合后也能夠對部分革蘭氏陰性菌起到致死作用[38]。在天然狀態下，Nisin有Nisin A和Nisin Z 2 種形式，后者的抑菌能力比前者強[39]。Nisin的抑菌機理是通過破壞有害菌細胞膜的完整性，以達到抑菌殺菌的作用。El-Kazzaz等[40]利用Nisin與常用抗生素氨芐青霉素和氯霉素共同抑制致病菌耐萬古霉素腸球菌時發現，添加Nisin會極大增強抗生素的殺菌活性，且耐萬古霉素腸球菌沒有對抗生素產生耐藥性，這表明Nisin和氨芐青霉素和氯霉素之間可以協同抑制致病菌的生長繁殖。這主要是因為Nisin會破壞有害菌的細胞膜，致使細菌細胞膜表面產生孔洞，從而導致有害菌內容物流出。同時，孔洞的形成也會促使更多抗生素快速進入細菌菌體內部，從而加速有害菌的凋亡[41]。Nisin的另一種抑菌機制是通過阻礙細胞壁的合成抑制有害菌生長，其主要會與有害菌細胞膜上的脂質Ⅱ發生相互作用，這使得脂質Ⅱ合成細胞壁的前體物質肽聚糖受阻，從而阻礙有害菌細胞壁的形成，抑制菌體繁殖[42]。

2.2.2 Ⅱ類肽類細菌素

Ⅱ類肽類細菌素可分為4 類：乳酸片球菌素、具有抗菌活性絡合物的雙肽細菌素、環狀細菌素和非片球菌素單一線性肽細菌素。Ⅱ類肽類細菌素的抑菌方式與Ⅰ類羊毛硫細菌素相似，主要是通過破壞細胞膜造成細胞質流失的方式來抑制細菌生長。例如，由植物乳桿菌TN635產生的乳酸片球菌素C端的α螺旋可以和有害菌細胞膜表面結合，增加胞體通透性，最終導致內容物流出，細菌凋亡[43]。研究表明，乳酸片球菌素對單核細胞增生李斯特氏菌具有良好的抑制作用[44]。雙肽類細菌素一般分為Lactococcin G和Thm B 2 類，其主要通過2 個不同的肽鏈相互作用達到抑菌效果。當2 個肽鏈相互作用時不僅可以抑制有害菌生長繁殖所需的ATP形成，還能夠抑制有害菌對氨基酸類營養物質的攝取，從而抑制細菌的生長和繁殖；但是當2 個肽鏈分開時就不具備抑菌作用[45]。環狀細菌素只對革蘭氏陽性菌起到一定的抑菌效果[20]。非片球菌素單一線性肽細菌素的抑菌機理與環狀細菌素相似，即通過改變有害菌細胞膜的通透性發揮抑菌作用。但是非片球菌素單一線性肽細菌素中的Bactofencin A細菌素除外，其主要通過與有害菌細胞壁上的負電荷反應，擾亂胞內胞外的代謝通路以達到抑菌效果[44,46]。

2.2.3 Ⅲ類熱敏感大分子蛋白

Ⅲ類細菌素是一種熱敏感大分子蛋白，分子質量一般大于30 kDa，其可以有效抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長[47]。Sun Zhilan等[48]研究發現，卷曲乳桿菌產生的卷曲乳桿菌素Helveticin M可破壞革蘭氏陽性菌的細胞壁和革蘭氏陰性菌的細胞膜，從而改變細菌細胞膜（壁）的通透性，有效抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌的生長繁殖；此外，卷曲乳桿菌素Helveticin M對肉中易滋生的金黃色葡萄球菌有抑制作用。

2.3 群體感應抑制劑抑菌

群體感應是微生物之間的一種通訊機制，微生物細胞會合成并釋放信號分子，通過信號分子的不斷積累可以調控并影響微生物相關基因的表達[49]。群體感應抑制劑是一類通過調控微生物群體感應系統來抑制腐敗菌的生長或降低其對環境耐受性的物質[20]。因此，通過群體感應抑制劑抑制或阻斷細菌之間的群體感應可以起到食品保鮮、延長食品保質期的作用。肉品極易受到金黃色葡萄球菌的污染而發生腐敗變質。研究表明，革蘭氏陽性菌分泌的自誘導肽類信號分子可以抑制金黃色葡萄球菌群體感應過程，影響其生理狀態及基因表達，抑制金黃色葡萄球菌繁殖，從而延長畜禽肉的保質期[50]。

2.4 競爭營養物質抑菌

生物保護菌會與腐敗菌競爭生長繁殖所必需的營養物質，從而達到抑制腐敗菌生長的目的。這種抑菌機制可以與其他抑菌機制同時發揮作用，延長食品的保質期[51]。Nilsson等[52]將棲魚肉桿菌和單核細胞增生李斯特氏菌混合培養。結果發現，棲魚肉桿菌的存在會導致單核細胞增生李斯特氏菌的數量減少，這主要是因為棲魚肉桿菌會與單核細胞增生李斯特氏菌競爭生長所需的營養物質，從而實現對其的抑制作用。

2.5 產生其他物質抑菌

除上述抑菌方式之外，生物保護菌還可以產生蛋白類物質、胞外多糖、CO2等物質來發揮抑菌作用。研究發現，棒狀乳桿菌Si3經酶解作用產生的蛋白類抑菌物質可以借助其疏水基團吸附到酵母菌或霉菌細胞上，從而影響酵母菌或霉菌細胞的生理活動，進而抑制其活性[53]。Wang Ji等[54]研究發現，植物乳桿菌YW32產生的胞外多糖可以有效抑制腐敗菌和致病菌生物膜的形成。CO2一方面會使周圍形成厭氧環境，抑制需氧微生物的生長繁殖，從而延緩食品腐敗進程；另一方面，CO2可通過自由擴散的方式進入有害菌菌體內，從而使細胞內環境的pH值下降，抑制胞內酶活性[55]，減緩細胞代謝，抑制細胞生長。

生物保護菌可以有效抑制肉品中腐敗菌的生長繁殖，具有高效、安全、環保的優點，但生物保護菌在維持肉品色澤方面不及氣調包裝。基于此，將2 種保鮮方式應用于肉品中不僅可以更好地維持視覺新鮮度，還可以有效延長肉品的貨架期。

3 生物保護菌聯合氣調包裝在肉品保鮮中的應用

3.1 在畜禽肉保鮮中的應用

目前已有很多關于利用氣調包裝處理畜禽冷鮮肉的研究，但將氣調包裝與生物保護菌聯合應用于畜禽肉中抑菌保鮮的相關研究并不多。相較于單一處理，聯合處理取得了更好的抑菌保鮮效果。Zhang Wenmin等[56]研究植物乳桿菌CICC-6257對不同CO2含量下的氣調包裝豬肉中單核細胞增生李斯特氏菌生長的影響。結果表明：生物保護菌與氣調包裝聯合應用能降低豬肉中單核細胞增生李斯特氏菌的最大生長率和最大種群密度；同時，聯合處理對單核細胞增生李斯特氏菌的抑制能力隨著CO2含量的增加而增強，結合其他指標最終篩選出植物乳桿菌CICC-6257在60% CO2含量下的氣調包裝處理對鮮豬肉的保藏效果最好。Melero等[57]為抑制氣調包裝雞肉中單核細胞增生李斯特氏菌和空腸彎曲桿菌等病原菌的生長，將偽星狀明串珠菌PCK18和長雙歧桿菌SSP分別接種到雞肉中，然后對接種后的雞肉進行氣調包裝和冷藏處理。24 d后發現，接種偽星狀明串珠菌PCK18雞肉中，單核細胞增生李斯特氏菌的數量明顯減少，接種長雙歧桿菌SSP的雞肉中空腸彎曲桿菌的數量也明顯降低，表明這2 種生物保護菌分別對單核細胞增生李斯特氏菌和空腸彎曲桿菌具有明顯的抑制效果。王強[58]將清酒乳桿菌與彎曲乳桿菌接種到熏雞腿表面后進行氣調包裝（60% CO2/40% N2），用以評估其生物保護作用。結果表明，清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌聯合氣調包裝的抑菌保鮮方式對熏雞腿的表面顏色、硬度和氣味的劣變都有很好抑制作用，它們還可以很好地抑制其他腐敗菌的生長，延長熏雞腿的保藏期。此外，將生物保護菌的產物有機酸類物質直接與氣調包裝聯合也可以很好地抑制肉品中腐敗菌的生長繁殖。Gon?alez-Fandos等[59]研究生物保護菌產生的有機酸（乳酸）對于氣調包裝條件下冷藏（4 ℃）雞腿中單核細胞增生李斯特氏菌的影響。結果發現，與只經過氣調包裝的雞腿相比，20% CO2/80% N2氣調包裝結合3.75%乳酸和3.75%山梨酸鉀處理的雞腿中單核細胞增生李斯特氏菌的數量顯著減少。這表明將生物保護菌的產物有機酸直接與氣調包裝結合應用于冷藏雞腿肉具有優良的抑菌前景。Yang Xiaoyin等[60]研究高氧氣調包裝（20% CO2/80% O2）和含CO的無氧氣調包裝（0.4% CO/30% CO2/69.6% N2）與生物保護菌結合對冷藏牛排色澤穩定性的影響，牛排冷藏20 d后發現，含CO氣調包裝的牛排中乳桿菌屬和乳球菌屬更好地保持了冷藏牛肉的色澤。這為利用生物保護菌結合氣調包裝的方式來提高肉品的視覺新鮮度提供了一定的理論依據。

3.2 在水產品保鮮中的應用

生物保護菌與氣調包裝聯合應用在水產品防腐抑菌中也發揮了良好的作用。Costa等[61]在氣調包裝及冷藏條件下，研究薩凱乳桿菌CTC494對金槍魚片中單核細胞增生李斯特氏菌的影響。結果發現，產酸菌薩凱乳桿菌CTC494對金槍魚片中腐敗菌單核細胞增生李斯特氏菌的生長起到明顯抑制作用，同時根據微生物和感官分析結果發現，當薩凱乳桿菌CTC494的接種量為4（lg（CFU/g））時，金槍魚片的感官質量最好，且此時薩凱乳桿菌CTC494對于單核細胞增生李斯特氏菌抑菌效果最優。

綜上所述，生物保護菌聯合氣調包裝的保鮮方法可以更好抑制有害菌的生長，保持肉品的顏色，延長肉品的貨架期。

4 結 語

生物保護菌聯合氣調包裝應用于肉品中可以彌補單純生物保護菌在肉品貯藏中色澤方面的不足[60]，同時也可以填補單純氣調包裝在肉品貯藏中某些特殊腐敗菌生長的缺口[62]。但是，生物保護菌與氣調包裝聯合處理的方法仍存在一些問題。一方面，肉及肉制品的貨架期與其所使用的包裝膜材料的阻隔性有一定的相關性[11]。因此，還要探索并改進氣調包裝的包裝材料，使其可以較長時間地維持包裝內氣體含量和比例不變，從而更好地維持肉品新鮮度[63]。另一方面，已發現可用于抑制有害微生物生長的生物保護菌種類并不多。目前只有Nisin是被允許直接添加到食品中的，而其他生物保護菌的安全性還有待進一步證實[64]。盡管生物保護菌聯合氣調包裝在食品領域仍存在一些問題，但從長遠來看，生物保護菌聯合氣調包裝的保鮮方式極具發展潛力。隨著更多無毒無害生物保護菌的出現以及氣調包裝進一步發展，二者的聯合很可能成為食品運輸和銷售過程中防腐保鮮、延長貨架期的重要手段，同時也會為其他食品的保鮮方式提供參考與借鑒。