大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽特性

曾允灝，陳德經,2,*，董夢堯，黨欣欣

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001）

大鯢（Andrias davidianus）分布廣泛，是有“活化石”之稱的兩棲動物，具有極高的營養價值和藥用價值，被譽為“生物界的活寶藏”[1]。大鯢肉占體質量的50%左右，滋味鮮美、營養豐富，富含多種生物活性物質，經常食用大鯢肉有益氣、養血、益智的功效，對神經衰弱、貧血、痢疾等疾病有輔助治療作用[2-3]。近年來對大鯢肉的研究主要集中在營養成分分析[4-5]、貯藏保鮮[6-7]、活性肽[8-9]等領域，而對大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽特性的研究報道極少。

大鯢肉含有肌漿蛋白、肌原纖維蛋白及肌基質蛋白，3 種蛋白占肌肉總蛋白比例為肌漿蛋白28.75%、肌原纖維蛋白52.87%、肌基質蛋白13.35%，將肌漿蛋白、肌原纖維蛋白提取后的剩余肉渣主要為肌基質蛋白，肌基質蛋白中主要含有膠原蛋白和彈性蛋白[9-10]。膠原蛋白具有特殊的三螺旋結構，分子中含有糖及大量的羥脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸等[11]。迄今為止，已發現的膠原蛋白有29 種，主要為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V五大類型，其中Ⅰ型含量較豐富[12]。彈性蛋白是一種高度不溶于稀酸、堿和鹽溶液，大量存在于皮膚、血管（主動脈）和肺組織中負責延展和彈性回縮的結構蛋白[13-14]。而膠原蛋白肽和彈性蛋白肽是膠原蛋白和彈性蛋白經特定蛋白酶酶解為小分子質量的多肽。膠原蛋白肽有利于皮膚膠原蛋白形成，也可增強骨膠原結構，促進動物體骨骼的形成，具有保護胃黏膜、抗過敏、防治骨質疏松、降血壓、促進毛發生長等作用[15-16]。彈性蛋白肽具有較強的抗氧化能力，在皮膚衰老進程中發揮著重要作用，可促進細胞遷移、生長和增殖，使皮膚具有較強的韌性和彈性[17]。目前，膠原蛋白肽和彈性蛋白肽在醫藥、化妝品、食品等高附加值領域中得到廣泛開發和應用[18-19]。

本研究以大鯢肌肉中提取獲得的肌基質蛋白為原料，分別用膠原蛋白酶及彈性蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽和彈性蛋白肽，研究其特性，以期實現大鯢肉利用率最大化，為大鯢肉肌基質蛋白進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢肌肉 漢中龍鯢生物工程股份有限公司。

風味蛋白酶（1.0×105U/g）、胃蛋白酶（5.0×104U/g）、膠原蛋白酶（1.0×105U/g） 陜西源優生物科技有限公司；彈性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；碳酸氫鈉、檸檬酸、甲醇、冰乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、體積分數95%乙醇溶液（均為分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、蛋白Marker、考馬斯亮藍G250、丙烯酰胺、四甲基乙二胺、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、甘氨酸、溴酚藍、β-巰基乙醇、甘油（均為電泳級） 生工生物工程（上海）股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DFY-1000搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；JA5003分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Xinyi-100F真空冷凍干燥機 寧波新藝超聲設備有限公司；TGL-20M冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；PE28 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1750紫外-可見分光光度計 日本島津儀器公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司；Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀 大昌華嘉商業有限公司；DYCZ-24DN垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司；SNB-2數字黏度計 上海倫捷機電儀表有限公司；Phenom臺式掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽制備

原材料預處理：大鯢肌肉解凍后，加入1%食鹽，水中浸泡30 min，流水清洗干凈，瀝干、絞碎。

大鯢肉肌基質蛋白制備：取大鯢肉糜500 g，加入4 倍體積0.05 mol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌輔助提取3 h，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀物中再加入上述磷酸鹽緩沖液，重復上述操作，將上清液合并即得水溶性肌漿蛋白；向沉淀中加入4 倍體積含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌輔助提取8 h，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，重復上述操作，合并上清液，即得鹽溶性肌原纖維蛋白；所得沉淀用蒸餾水反復洗滌3 次，即得肌基質蛋白。將肌基質蛋白冷凍干燥，粉碎成粉末置于-20 ℃冰箱備用[10]。

膠原蛋白肽制備：稱取肌基質蛋白粉末20.000 g，按料液比1∶2、pH 7.0加入0.200 g膠原蛋白酶于37 ℃水浴鍋中，攪拌酶解4.5 h后，沸水浴10 min滅酶，冷卻至室溫；將酶解液于10 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥得膠原蛋白肽粉。

彈性蛋白肽制備：稱取肌基質蛋白粉末20.000 g，按料液比1∶2、pH 7.8加入0.200 g彈性蛋白酶于37 ℃水浴鍋中，攪拌酶解4.5 h后，沸水浴10 min滅酶，冷卻至室溫；將酶解液于10 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥得彈性蛋白肽粉。

膠原蛋白肽和彈性蛋白肽提取率分別按式（1）～（2）計算。

式中：m1為膠原蛋白肽粉質量/g；m2為肌基質蛋白粉質量/g；m3為彈性蛋白肽粉質量/g。

1.3.2 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紫外光譜測定

配制質量濃度為1 mg/mL樣品溶液，用紫外-可見分光光度計測定200～800 nm波長的吸光度，測定膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紫外光譜。

1.3.3 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紅外光譜測定

準確稱取100.0 mg溴化鉀粉末3 份，1 份為空白對照，另2 份分別與1 mg膠原蛋白肽粉和1 mg彈性蛋白肽粉樣品混勻，置于瑪瑙缽體中研成細粉后進行壓片。使用紅外光譜儀測定4 000～400 cm-1區間內的紅外光譜[10]。

1.3.4 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽氨基酸組成及含量測定

參考陳德經[20]方法稍作修改，分別稱取0.500 g膠原蛋白肽和彈性蛋白肽樣品于安培瓶內，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，充氮氣30 s重復3 次，封口，于110 ℃恒溫干燥箱內水解24 h，取出冷卻后，將水解液過濾，定容至50 mL容量瓶，吸取濾液1 mL定容至5 mL容量瓶內，在50 ℃真空干燥箱干燥，殘留物用1 mL 6 mol/L鹽酸溶液水解，再干燥，重復2 次，最后蒸干，加入1 mL pH 2.2的0.2 mol/L檸檬酸緩沖液溶解，過0.22 μm微孔濾膜后注入Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀測定氨基酸組成及含量。

1.3.5 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析

采用5%濃縮膠、12%分離膠對膠原蛋白肽和彈性蛋白肽進行SDS-PAGE測定[21]。

1.3.6 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽物理特性測定

1.3.6.1 黏度測定

準確稱取一定量膠原蛋白肽和彈性蛋白肽樣品于試管中加蒸餾水混勻后，配制成2.5 mg/mL樣品溶液，用黏度計測定SP2、SP3轉子下的黏度。

1.3.6.2 掃描電子顯微鏡觀察

取一定量膠原蛋白肽和彈性蛋白肽粉末，將直徑12 mm雙面碳導電膠片粘貼在釘型樣品臺上，而后將樣品均勻覆蓋在膠片表面，用鑷子將釘型樣品臺夾起放置于電鏡標準樣品杯中，旋轉樣品杯，動力除塵器除去灰塵后放置于電鏡載物臺，調節最佳視野和放大倍數對樣品進行微觀結構觀察。

1.3.7 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽體外抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除率測定

將膠原蛋白肽和彈性蛋白肽分別加蒸餾水溶解，配制質量濃度2.0～10.0 mg/mL樣品溶液。取3 mL樣品溶液于試管中，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（用體積分數95%乙醇溶液配制），振蕩混勻后避光放置30 min，在517 nm波長處測定吸光度，用蒸餾水調零，0.5 mg/mL抗壞血酸溶液作為陽性對照。平行測定3 次。DPPH自由基清除率按式（3）計算[22]。

式中：A0為蒸餾水+DPPH溶液吸光度；A1為樣品+DPPH溶液吸光度；A2為樣品+體積分數95%乙醇溶液吸光度。

1.3.7.2 O-2·清除率測定

將膠原蛋白肽和彈性蛋白肽分別加蒸餾水溶解，配制質量濃度2.0～10.0 mg/mL樣品溶液。取1 mL樣品溶液于試管中，各加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和0.1 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液充分混勻，于25 ℃水浴反應10 min，加入1 mL 8 mmol/L鹽酸溶液終止反應。在320 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水作為空白對照，0.5 mg/mL抗壞血酸溶液作為陽性對照。實驗重復3 次，O-2·清除率按式（4）計算[23]。

式中：A3為不加樣品溶液、加鄰苯三酚溶液吸光度；A4為加樣品溶液和鄰苯三酚溶液吸光度；A5為加樣品溶液、不加鄰苯三酚溶液吸光度。

1.4 數據處理

采用Origin Pro 2021軟件進行繪圖，Excel軟件進行數據統計分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽提取率

蛋白酶中含有特定蛋白酶切位點，能最大化地將大分子蛋白切割成較小分子的多肽。采用膠原蛋白酶及彈性蛋白酶酶解大鯢肉肌基質蛋白，由圖1可知，膠原蛋白酶的提取率為（45.11±2.11）%，高于彈性蛋白酶的提取率（37.36±2.98）%，表明大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白含量高于彈性蛋白含量。

圖1 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽的提取率Fig.1 Yields of peptides with collagenase and elastase

2.2 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紫外光譜分析

蛋白質存在的不飽和結構肽鍵、羧基、苯環等都會對紫外光區有吸收。在波長200～800 nm對膠原蛋白肽和彈性蛋白肽樣品進行紫外波長掃描，由圖2可知：膠原蛋白肽最大吸收峰出現在210～230 nm，符合膠原蛋白肽的特征吸收峰[24]，在波長260～280 nm也有一定的吸收，但吸收峰較小，說明大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽含有一定量的芳香族氨基酸；彈性蛋白肽最大吸收峰出現在200～220 nm，在波長260～280 nm沒有明顯吸收峰，說明大鯢肉肌基質蛋白中彈性蛋白肽的芳香族氨基酸含量較少。

圖2 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of collagen-derived and elastin-derived peptides from muscle matrix protein of giant salamander

2.3 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紅外光譜分析

在紅外光譜中，紅外輻射樣品，其中一部分被吸收，一部分被透射，不同的樣品會產生不同的紅外光譜。由圖3可知，2 種樣品有相似的紅外光譜特征吸收峰，均在酰胺A帶（3 295.37 cm-1左右）、酰胺B帶（2 925.90 cm-1左右）和酰胺Ⅱ帶（1 500～1 600 cm-1）有明顯的吸收峰，但也存在一定差異。酰胺A帶與N—H和—OH基團伸縮振動有關，波數區間為3 300～3 340 cm-1，2 種樣品在3 295.37 cm-1有特征吸收峰，可能是因為氫鍵的形成，N—H基團的伸縮振動向低波數移動100 cm-1[25]。膠原蛋白肽在1 657.09 cm-1處有明顯吸收峰，位于酰胺Ⅰ帶（1 600～1 660 cm-1），是C＝O基團的特征譜帶，在1 243.73 cm-1處有明顯吸收峰，位于酰胺Ⅲ帶（1 245～1 235 cm-1），是膠原蛋白特有吸收峰，說明膠原蛋白肽具有三螺旋結構[26]。彈性蛋白肽在1 398.54 cm-1處有明顯吸收峰，可能是C—H彎曲振動引起的[27]。

圖3 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of collagen-derived peptide and elastin-derived peptides from muscle matrix protein of giant salamander

2.4 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽氨基酸組成及含量測定結果

蛋白質的生物活性與其氨基酸分布及R基團和芳香族氨基酸側鏈組成密切相關[28]。由表1可知：大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽含有7 種人體必需氨基酸，分別是蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸；膠原蛋白肽TAA和必需氨基酸含量均高于彈性蛋白肽，這是因為大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白含量高于彈性蛋白；與膠原蛋白肽氨基酸組成相比，彈性蛋白肽HAA含量相對較高，AAA含量較低，這與紫外光譜結果一致；彈性蛋白肽中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸和亮氨酸含量相對較高，組氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸含量較低，均低于1.00 g/100 g，符合劉洋[29]所測不同酶解時間彈性蛋白水解產物的總氨基酸組成。

表1 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition and content of collagen-derived and elastin-derived peptides g/100 g

2.5 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽SDS-PAGE測定結果

由圖4可知，在分子質量13～150 kDa的Marker標記范圍內，幾乎沒有膠原蛋白肽和彈性蛋白肽的條帶存在，說明在酶解作用下，大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白和彈性蛋白大分子完全被酶解為小于13 kDa的小分子多肽。

圖4 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE profiles of collagen-derived and elastin-derived peptides from muscle matrix protein of giant salamander

2.6 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽物理特性測定結果

2.6.1 黏度

蛋白黏度的主要影響因素是其分子質量、溫度、濃度等。由圖5可知，在相同濃度、溫度下，彈性蛋白肽樣品在SP2和SP3轉子下的黏度分別為（0.050±0.002）、（0.089±0.003）Pa·s，高于膠原蛋白肽的（0.027±0.002）、（0.067±0.002）Pa·s，這可能是因為彈性蛋白肽的分子質量較大，使其黏度高于膠原蛋白肽[30]。

圖5 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽黏度Fig.5 Viscosity of collagen-derived and elastin-derived peptides from muscle matrix protein of giant salamander

2.6.2 掃描電子顯微鏡觀察

由圖6可知，大鯢肉肌基質蛋白分別用膠原蛋白酶和彈性蛋白酶酶解后，其微觀結構明顯不同，膠原蛋白肽結構呈海綿狀，片狀較大，交聯度高；彈性蛋白肽結構呈現出大小不一的碎片狀，結構較為松散，交聯度較低。

圖6 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽掃描電子顯微鏡圖（×740）Fig.6 Scanning electron micrographs of collagen-derived and elastin-derived peptides from muscle matrix protein of giant salamander (× 740)

2.7 膠原蛋白肽和彈性蛋白肽體外抗氧化活性

2.7.1 DPPH自由基清除率

由圖7可知，膠原蛋白肽和彈性蛋白肽對DPPH自由基均有一定的清除作用，在樣品質量濃度為2.0～10.0 mg/mL，隨著樣品質量濃度增大，對DPPH自由基的清除能力增大。在10 mg/mL時，膠原蛋白肽對DPPH自由基清除率為（72.05±1.17）%，其半抑制質量濃度（IC50）為6.95 mg/mL，高于彈性蛋白肽對DPPH自由基的清除率（62.12±1.34）%，IC50為8.48 mg/mL。這可能是因為膠原蛋白肽中氨基酸含量高于彈性蛋白肽。而抗壞血酸的清除能力較強，在質量濃度為0.5 mg/mL時DPPH自由基清除率已超過90%。

圖7 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽對DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH radical scavenging effect of collagen-derived and elastin-derived peptides from muscle matrix protein of giant salamander

2.7.2 O-2·清除率

由圖8可知，膠原蛋白肽和彈性蛋白肽對O-2·均有一定的清除作用，在樣品質量濃度為2.0～10.0 mg/mL范圍內，隨著樣品質量濃度增大，對O-2·清除能力增大。在10 mg/mL時，膠原蛋白肽對O-2·的清除率為（75.47±0.58）%，其IC50為6.39 mg/mL，高于彈性蛋白肽對O-2·的清除率（64.34±1.34）%，IC50為8.17 mg/mL。而抗壞血酸的清除能力較強，在質量濃度為0.5 mg/mL時O-2·清除率已超過90%。

圖8 大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白肽和彈性蛋白肽對O-2·的清除率Fig.8 Superoxide anion radical scavenging effect of collagen-derived and elastin peptides from muscle matrix protein of giant salamander

3 結 論

以大鯢肌肉中提取獲得的肌基質蛋白為原料，分別用膠原蛋白酶及彈性蛋白酶酶解制備膠原蛋白肽和彈性蛋白肽，研究其基礎特性，并測定其對DPPH自由基、O-2·的清除能力。結果表明，按料液比1∶2、加酶量1%，在37 ℃條件下，分別用膠原蛋白酶（pH 7.0）和彈性蛋白酶（pH 7.8）酶解肉渣4.5 h，得到膠原蛋白酶的提取率為（45.11±2.11）%，高于彈性蛋白酶的提取率（37.36±2.98）%，說明大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白的含量高于彈性蛋白。

膠原蛋白肽紫外吸收波長主要為210～230、260～280 nm，而彈性蛋白肽主要為200～220 nm，在波長260～280 nm沒有明顯吸收，表明彈性蛋白肽中芳香族氨基酸含量較少；膠原蛋白肽和彈性蛋白肽的紅外光譜圖均在酰胺A帶（3 295.37 cm-1左右）、酰胺B帶（2 925.90 cm-1左右）和酰胺Ⅱ帶（1 500～1 600 cm-1）帶有特征吸收峰，膠原蛋白肽在1 243.73 cm-1處有明顯吸收峰，位于酰胺Ⅲ帶（1 245～1 235 cm-1），是膠原蛋白特有吸收峰，說明膠原蛋白肽具有三螺旋結構。膠原蛋白肽和彈性蛋白肽中氨基酸組成豐富，含有7 種人體必需氨基酸，其中必需氨基酸含量分別占總氨基酸的42.61%和44.54%，膠原蛋白肽氨基酸總量和必需氨基酸含量均高于彈性蛋白肽。

SDS-PAGE分析結果表明，大鯢肉肌基質蛋白中膠原蛋白和彈性蛋白大分子蛋白完全被酶解為分子質量小于13 kDa的小分子多肽；膠原蛋白肽和彈性蛋白肽均具有一定的黏性，在相同濃度下，彈性蛋白肽黏性高于膠原蛋白肽；掃描電子顯微鏡結果表明，不同酶酶解大鯢肉肌基質蛋白后樣品的微觀結構不同，與膠原蛋白肽結構相比，彈性蛋白肽結構較為松散，交聯度較低。體外抗氧化實驗結果表明，膠原蛋白肽和彈性蛋白肽對DPPH自由基、O-2·均具有良好的清除效果，且質量濃度與清除率呈正比，膠原蛋白肽清除能力優于彈性蛋白肽，說明將大鯢肉肌漿蛋白、肌原纖維蛋白提取后的剩余肉渣，仍可以利用膠原蛋白酶和彈性蛋白酶制備膠原蛋白肽和彈性蛋白肽，提高大鯢肉的利用率及經濟價值。